SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)
Princip
SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza
slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti
(molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za
denaturačních a redukčních podmínek dochází k jeho
denaturaci a navázání molekul SDS (dodecylsulfátu
sodného), který udělí proteinu vysoký záporný náboj
přímo úměrný jeho hmotnosti. Je to dáno tím, že SDS se
váže na proteiny v poměru 1.4 g SDS na 1 g bílkoviny.
Po nanesení vzorku (proteinu) na gel a umístění gelu do
elektrického pole, dochází k migraci proteinů ke kladné
elektrodě (anodě). Během této migrace jsou proteiny
separovány na principu molekulového síta
v polyakrylamidovém gelu (Obrázek 1.). Po následné
vizualizaci separovaných proteinů v gelu se dá určit
jejich relativní molekulová hmotnost srovnáním délky
migrace se standardem o známé molekulové hmotnosti.
Koncentrace akrylamidu použitého k přípravě gelu závisí
na velikostech proteinů, které chceme separovat. Nízká
koncentrace se používá k separaci proteinů o vysoké
molekulové hmotnosti, zatímco vysoká koncentrace se
používá k separaci proteinů o malé molekulové
hmotnosti (viz tabulka 1).
Tabulka 1. Separační schopnosti SDS-PAGE gelů
Koncentrace
Akrylamidu (%)
Oblast lineární
separace (kDa)
15.0 12–43
10.0 16–68
7.5 36–94
5.0 57–212
V praxi se pro separace proteinů velmi často používá tzv. diskontinuální elektroforéza
skládající se ze dvou gelů, koncentračního a separačního (Obrázek 2). Tyto gely mají různá
pH, kdy koncentrační gel má pH cca. 6,8, při kterém mají ionty obsažené v gelu nízkou
mobilitu. Na rozdíl od toho, separační gel má pH cca. 8,8, kdy mobilita iontů v gelu je
vysoká. Protože systémem protéká konstantní proud, musí dle Ohmova zákona být R
koncentračního gelu vyšší než R separačního gelu. Při dostatečně odlišné koncentraci pufru
v koncentračním a separačním gelu, bude napětí v koncentračním gelu dostatečně vyšší než
napětí v separačním gelu, aby kompenzovalo rozdíl v mobilitách iontů. V systému je poté
mobilita separovaných proteinů následující: mkonc. gel < proteiny < msep. gel. Díky této své
mobilitě se separované proteiny na rozhraní gelů zkoncentrují a seřadí dle svých mobilit.
Důležité je, aby koncentrační gel obsahoval nízkou koncentraci polyakrylamidu a nebránil
tak proteinům v pohybu.
Obrázek 1. Princip SDS PAGE
separace
Obrázek 2. Princip diskontinuální elektroforézy
Příprava gelu
Složení sendvičové kazety pro nalití gelu
a. Umístěte nalévací stojan a rámečky na rovnou podložku.
b. Vezměte delší skla se spacery o tloušťce 1.0 mm a umístěte na ně kratší skla.
c. Umístěte skla do nalévacího rámečku tak, že popis na delším skle je orientován
nahoru.
d. Zaklapněte skla oběma klipsnami zároveň.
e. Umístěte nalévací rámeček se skly na nalévací stojan (nezapomeňte umístit na
stojan těsnící podložku) a přitlačte je pomocí pružinky.
Bod b.) Bod c.)
Bod d.) Bod e.)
Nalévání separačního gelu
a. Na základě Tabulky 2. namíchejte směs pro 10% separační gel do 100 ml
erlenmayerovy baňky a promíchejte. Jako poslední přidávejte persíran amonný.
b. Pomocí 5 ml pipety nalijte připravený gel mezi připravená skla tak, aby od okraje
kratšího skla zůstala mezera cca. 1 cm.
c. Převrstvěte opatrně nalitý gel tenkou vrstvou vodou.
d. Po 20 minutách vyndejte nalévací rámeček se skly z nalévacího stojanu a pomocí
filtračního papíru odsajte vodu na povrchu polymerovaného gelu.
e. Vraťte nalévací rámeček se skly do nalévacího stojanu.
Nalévání koncentračního gelu
a. Na základě Tabulky 2. namíchejte směs pro koncentrační gel do 100 ml
erlenmayerovy baňky a promíchejte. Jako poslední přidávejte persíran amonný.
b. Pomocí 5 ml pipety nalijte připravený gel mezi připravená skla na již ztuhlý separační
gel tak, aby koncentrační gel byl nalit až po okraj kratšího skla.
c. Poté opatrně zasuňte mezi skla hřebínek o tloušťce 1.0 mm.
d. Po 20 minutách vyndejte nalévací rámeček se skly z nalévacího stojanu, vyndejte
opatrně hřebínek a vzniklé jamky propláchněte mili-Q vodou.
Tabulka 2. Složení směsi pro nalévání gelu
Koncentrační gel Separační gel
Procentní gel (%) 5 Procentní gel (%) 10
30% Akrylamid (ml) 1.7 30% Akrylamid (ml) 6.7
1M Tris(pH6.8) (ml) 1.25 1.5M Tris(pH8.8) (ml) 5
10% persíran amonný (ml) 0.1 10% persíran amonný (ml) 0.2
10% SDS (ml) 0.1 10% SDS (ml) 0.2
TEMED (ml) 0.01 TEMED (ml) 0.008
H2O (ml) 6.8 H2O (ml) 7.9
Celkový objem (ml) 10 Celkový objem (ml) 20
Sestavení aparatury
a. Vyjměte skla z nalévacího rámečku a umístěte je každé sklo do drážek
v elektrodovém držáku. Skla musí být umístěna tak, že kratší skla jsou orientována
dovnitř směrem k sobě, čímž vytváří vaničku pro nalití pufru.
b. Takto připravený elektrodový držák se skly zasuňte do upínacího rámečku.
c. Gely přitlačte na zelené těsnění pomocí klipsen.
d. Upínací rámeček poté vložte do elektrodové vany.
e. Do komůrky mezi skly v elektrodovém držáku nalijte elektrodový pufr (až po okraj,
cca. 125 ml). Do elektrodové vany nalijte potom asi 200 ml elektrodového pufru.
Bod a.)
Bod d.)
Bod c.) Bod c.)
Nanesení vzorku
a. Před nanesením vzorku smíchejte 42 µl vzorku s 8 µl nanášecího pufru a umístěte
vzorek a délkového standard na 5 minut do termobloku vyhřátého na 95°C.
b. Poté vzorek a standard zchlaďte na ledu.
c. Do horní vaničky si vložte pomocnou vložku pro nanášení vzorku.
d. Do jednotlivých jamek nanášejte pomocí Hamiltonovy pipety 20 µl vzorku. Do jedné
jamky poté naneste 10 µl délkového standardu.
Vlastní elektroforéza
Elektroforetickou aparaturu uzavřete víkem a připojte ji ke zdroji stejnosměrného
napětí. Na zdroji nastavte konstantní proud 30 mA/gel a po zapnutí ponechte elektroforézu
probíhat tak dlouho, až zóna bromfenolové modři doputuje ke spodnímu okraji gelu.
Ukončení elektroforézy
Vypněte zdroj, otevřete elektroforetickou aparaturu, vyjměte z ní vnitřní elektrodový
prostor, a slijte elektrodový pufr. Uvolněte z vnitřního elektrodového prostoru držák s gelem
a opatrným zapáčením od sebe uvolněte skla. Z gelu odstraňte koncentrační část a zbytek
přeneste do vody.
Protokol pro barvení gelů stříbrem
a. Ponořte gel na 7 minut do 7% k. octové
b. Ponořte gel na 10 minut do 50% metanolu
c. Znovu ponořte gel na 10 minut do 50% metanolu
d. Připravte si roztok A: 0.8 g dusičnanu stříbrného + 4 ml vody
e. Propláchněte gel po dobu 10 minut v 100 ml vody
f. Propláchněte gel po dobu 10 minut v 100 ml vody
g. 5 minut před posledním promytím připravte roztok B: 21 ml vody + 25 ul 30% NaOH +
1.4 ml 14.8 M hydroxidu amonného
h. Připravte barvící roztok: Roztok B umístěte na míchačku a za neustálého míchání
přidejte po kapkách roztok A. poté přidejte 76 ml mili-Q vody.
i. Ponořte gel na 15 minut do barvícího roztoku.
j. Propláchněte gel po dobu 5 minut v 100 ml vody
k. Znovu propláchněte gel po dobu 5 minut v 100 ml vody
l. Připravte vyvíjecí roztok: Smíchejte 200 ml mili-Q vody s 1 ml 1% k. citronové a 100 µl
37% formaldehydu.
m. Ponořte gel do vyvíjecího roztoku a inkubujte ho, dokud nejsou viditelné proužky
(obvykle 2-10 minut).
n. Ukončete vyvíjení propláchnutím 3 x 200 ml vody
Složení pufrů
Nanášecí pufr:
250 mM TrisHCl pH6.8
10% SDS
30% Glycerol
5% β-merkaptoethanol (nebo 0.5M DTT)
0.02% bromfenolová modř
10 x SDS elektroforetický pufr
TRIS 30.3 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
Doplnit do 1l vodou (pH se neupravuje, směs má hodnotu cca. 8,8)