Úloha lipidových komponent v buněčných signalizacích (vybrané modely a metody detekce) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno Metody používané v laboratoři cytokinetiky BFÚ AV ČR, Brno Legenda: FACS - průtoková cytometrie FM - fluorescenční mikroskop SM - světelný mikroskop WB - western blotting FM - fluorimetrie (FluoStar) CM - kolorimetrie (FluoStar nebo Elisa reader) LM - luminometrie (VUVEL, Lojek) PAGE - polyakrylamidová elektroforéza RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction RG - radiografie ELFO – agarosová elektroforéza Přehled metod a metodologií Možné přístupy při studiu „chování“ buněčných populací Foreign Invited Speakers J. Bergervoet (Netherlands) D. Marie (France) G. Mazzini (Italy) (M. Z. Ratajczak) M. Kucia (USA) J. P. Robinson (USA) H. M. Shapiro (USA) J. Szöllösi (Hungary) Welcome of Modely Buňky in vitro Řada buněčných linií in vitro odvozené od různých typů nádorových i nenádorových tkání, mezi nimi zejména: • krvetvorné (HL-60, U937, lidské promelocytární linie) • střevní epitel (linie lidského adenokarcinomu kolonu HT-29, embryonální linie FHC) • jaterní tkáň (myší Hepa 1, nádorové krysí buňky WB-F344) Fagocyty a lymfocyty: • izolované z krve myší a zdravých lidských dobrovolníků • buněčná linie myších peritoneálních makrofágů RAW 264 Studie in vivo Laboratorní myši kmenů CBA, C57B1, nebo jejich kříženci (event. lab. potkani) • změny krvetvorby- myši s krvetvorbou normální nebo utlumenou ionizujícím zářením či aplikací cytostatika podávány testované substance • nádorový růst- u myši s experimentálně implantovaným nádorem sledovány efekty léčby testovanými substancemi na nádorový růst • zánětlivý/septický model- myšíme intraperitoneálně podáván endotoxin (10 mg/kg) rozpuštěný ve fyziologickém roztoku. Současně nebo následně mohou být podávány také studované látky event. lipidové emulze apod. Studované parametry a metodické přístupy ÚROVEŇ BUNĚČNÁ Oxidační a antioxidační vlastnosti emulzí, změny spekter buněčných lipidů a mastných kyselin (HPLC, plynová chromatografie) Produkce superoxidového aniontu, peroxidu vodíku, hydroxylového radikálu, oxidu dusnatého a působení na PUFA, lipidy a buňky (luminometrie, fotometrie, elektrochemie) ÚROVEŇ MOLEKULÁRNÍ A BUNĚČNÁ Exprese buněčných receptorů, exprese a aktivita specifických kináz (ERK, JNK atd.) a transkripčních faktorů (PPAR, NFkB..), exprese genů a proteinů zapojených v regulaci buněčného cyklu (p21, cykliny, CDK atd.), apoptózy (proteiny Bcl2 rodiny atd.) a buněčné adheze (FAK, Ecatherin, integriny atd.) - detekce pomocí elektroforetických metod, Western blottingu, PCR, fluorimetrie, multiparametrické flow cytometrie. ÚROVEŇ buněčných POPULACÍ A TKÁNÍ Změny cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) a oxidativního metabolismu (flow cytometrie, fluorimetrie, fluorescenční mikroskopie) Extra- a intracelulární tvorba reaktivních metabolitů kyslíku a dusíku buňkami, peroxidace lipidů (luminometrie, flow cytometrie, fotometrie, Western blotting) Akumulace triacylglycerolů v cytoplasmě buněk ovlivněných různými složkami lipidových emulzí, fluidita membrán (HPLC, plynová chromatografie, fluorimetrie) Komplexní analýza krvetvorby pokusných myší - stanovení počtů jednotlivých typů buněk v periferní krvi a krvetvorných orgánech, vyhodnocení stavu poolu progenitorových buněk pro granulocyty, makrofágy ( GM-CFC ) a erytrocyty ( BFU- E ). Zavedené modely a vybrané metodické možnosti (v kooperaci) Podrobněji Doc. J. Hofmanová buněčné linie (tkáňové kultury) Přechod adenom x karcinom fetální colon FHC adenomy AA/C1 RG/C2 adenocarcinomy HT-29 HCT116 lymf. metastáza SW-620 Buněčné línie Inhibiční účinky butyrátu Buňky epiteliálního původu PatologieOrganismusLokalizaceOznačení karcinomkrysajátraH4IIELuc embryonálníčlověkkolonFHC normálnímyšplicníE10 karcinommyškolorectumCT26 karcinom, doxorubicin - rezistentní člověkplíceCOR-L23R karcinom, Pt - rezistentníčlověkplíceCOR-L23/CP3 karcinomčlověkplíceCOR-L23 karcinom, Pt- citlivéčlověkovariumCH-1 normálnínorekplíceCCL-64 adenokarcinomčlověkkolonCaCo2 tranformované viremčlověkplíceBEAS-2B karcinomčlověkplíceA549 karcinom, Pt - rezistentníčlověkováriumA2780cis karcinom, Pt - citlivéčlověkováriumA2780 Buňky epiteliálního původu PatologieOrganismusLokalizaceOznačení normálníkrysajátraWB-F344 karcinomčlověkprsT47D adenokarcinom, Pt – primárně rezistentní člověkovariumSKOV-3 adenokarcinomčlověkprsMVLN normálnípesledvinaMDCK adenokarcinomčlověkprsMDA-MB-231 adenokarcinomčlověkprsMCF-7 embryonální (fibroblasty)člověkplíceLEP embryonálníčlověkendotelHUVEC adenokarcinomčlověkkolonHT115 adenokarcinomčlověkkolonHT-29 karcinomčlověkjátraHepG2 karcinommyšjátraHepa1 karcinomčlověkcervixHeLa normálníčlověkepidermisHaCaT PatologieOrganismusLokalizaceOznačení Buňky mezenchymálního původu leukemie (lymfoidní)myškrevWEHI normální (fibroblasty)křečekfibroblastyV79 leukemie (monocytární)člověkkrevU937 leukemie (myeloidní)člověkkrevNB4 leukemie (myeloidní)člověkkrevML-1 leukemie (lymfoidní)člověkkrevMOLT-4 leukemie (erytroidní)člověkkrevK562 leukemie (lymfoidní)člověkkrevJurkat imortalizovanénervovéIMM leukemiečlověkkrevHL-60 fibrosarkommyšG5:113 LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly DAPI staining Studium morfologických změn buněčného jádra apoptotických buněk FM Annexin V - FITC + propidium jodid (PI) Externalizovaný fosfatidylserin apop. buněk + zachovaná semipermeabilita (detekce rané apoptózy) FACS, FM TUNEL + PI Průkaz specifické fragmentace DNA (DNA zlomů - nicků – ss DNA breaks) FACS, FM SubG0/G1 peak v distribuci buněčného cyklu Barvení buněčné DNA propidium jodidem s extrakcí nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem FACS PI - Hoechst double - stain Rozdělení buněk na mrtvé/živé, podle morfologie jádra identifikace apoptotických buněk FM DNA žebřík Průkaz fragmentace DNA na 180 bp fragmenty (tzv. ladder) ELFO Kaspáza 1, 3, 7, 8, 9 Detekce exprese specifických proteáz WB Caspase assay (c-3, -6, -8, -9 subs.) Důkaz aktivity specifických proteáz štěpením specifické sekvence na fluorescenční substrát FM cytokeratin 18 - protilátka M30 Neoepitop vytvořený štěpením cytokeratinu kaspázou FACS, Lamin B Degradace Laminu B kaspázami WB PARP Detekce štěpení proteinu PARP WB JC-1, TMRE, DiOC6, MitoTracker Red, Rh 123 Detekce změn mitochondriálního potenciálu DYm FACS Hoechst + propidium jodid (PI) Detekce apoptických, nekrotických a sekundárně nekrotických buněk (detekce i pozdní apoptózy) FM F-aktin Detekce intenzity polymerizace a depolymerizace aktinu (pomocí konjugátu faloidin-FITC) FCM, FM Intracelulární pH Průkaz poklesu intracelulárního pH vůči fyziol. hodnotě nutného k aktivaci enzymu DNA-ázy Izolace cytochromu c z cytos. frakce Vylití Cyt. C z mitochondríí do cytosolu a formování komplexu s Apaf-1 a procasp-9 vytváří apoptosom WB OxPhos Complex IV subunit II Studium funkce mitochondrií WB Metody průkazu apoptotické formy buněčné smrti Proteiny a molekuly spojené s procesem apoptózy Bad, Bag-1, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-X, BclXL, Bid, Mcl-1 Bcl-2 rodina - regulátory průběhu apoptózy WB c-FLIP Inhibitor kaspázy 8 WB c-IAP1, XIAP Rodina inhibitorů kaspáz WB Hydroethidin, 2´,7´ dichlorofluoresceindiacetát Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS Dihydrorhodamin 123 Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS Lucigenin Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu LM LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Metody stanovení úrovně proliferace, cytotoxicity, viability LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Počítání buněk Počítač částic založený na principu konduktivity Coulter counter Dye exclusion assay - eosin, trypanová modř Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou SM Dye exclusion assay - propidium jodid Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou FACS MTT, WST-1 Stanovení relativního množství buněk metabolizujících tetrazolove soli MTT, WST-1 na formazanove produkty CM CyQuant Kit (Molecular Probes) pro značení DNA speciální fluorescenční barvou - proliferační assay FM PCNA Marker proliferace - podjednotka DNA-polymerázy d a e WB, SM Inkorporace BrdU Analog deoxyuridinu se inkorporuje během replikace DNA v proliferujích buňkách FACS, FM Inkorporace 3H-thymidinu (izotopová metoda) Triciem značený thymidin se inkorporuje do buněk během replikace DNA - scintilační hodnocení RG Clonogenic assay Otreatované buňky rostou v médiu nebo na agaru, sleduje se schopnost vytvářet kolonie buněk Metody analýzy buněčného cyklu LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Proteiny spojené s regulací buněčného cyklu Barvení pomocí PI (např. Vindelův roztok) Distribuce buněčné populace podle množství celkové buněčné DNA do jednotlivých fáz bun. Cyklu FACS Mouse anti-BrdU-FITC + PI Sledování syntézy DNA na základě inkorporace BrdU do DNA proliferujících buněk FACS Pulse-chase BrdU labeling Sledování průchodu buněk cyklem FACS cyklin A Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cdk 2 WB cyklin D1 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cdk 4 WB cdk 2 activity assay Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cyklinem A RG cdk 4 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cyklinem D WB p15, 16 Rodina p16 - inhibující kinázy cdk 4 a 6 WB p21/waf1/cip1/sdi1/pic1 Inhibitor cdk a DNA replikace, transaktivovaný pomocí p53 WB p27/kip1 Inhibitor komplexů cyklin D-cdk 4, cyklin A-cdk 2 WB Topoizomeráza IIa Replikační faktor - marker pozdní S/G2/M fáze b. cyklu WB pRb Onkosupresor zastavující ve fosforylované formě b. cyklus v souvislosti s p21 WB p53 Tumor supresorový gen - "Guardian of the genome" - downstream reguluje p21/waf WB LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Metody detekce diferencujících se buněk LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Proteiny spojené s diferenciací buněk LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly CD11b, CD14 Znaky monocytární diferenciace lidských leukemických buněk FACS Nespecifické esterázy Stanovení aktivity a-naftyl acetát esterázy (difer. leukemických buněk) CM Fagocytická aktivita Znak monocytární diferenciace leukem. buněk - pohlcení částic konjug. s FITC FACS NBT redukční test Se zvyšující se úrovní diferenciace roste počet reduk. formazánových zrn CM Aktivita alkalické fosfatázy Znak diferenciace kolonových buněk - disodná sůl 4-nitrofenyl fosfátu CM Nespecifické esterázy Stanovení aktivity nespecifických esteráz pomocí štěpení fluoresenčné sondy CFDA (karboxyfluorescein diacetát) FACS Intracelulární pH Stanovení intracelulárního pH jako markru diferenciace buněk pomocí flourescenční sondy SNARF-1 FACS Polymerizace aktinu FITC značený faloidin FM RARa Receptor all-trabs retinoic acid, indukující diferenciaci leukemických buněk WB RXRa Receptor aktivovaný 9-cis-retinovou kyselinou WB VDR Receptor vitaminu D, množství VDR moduluje růst a diferenciaci nádorových buněk WB Mezibuněčná komunikace, anoikis, motilita buněk LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Metabolismus kyseliny arachidonové LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly FAK Nereceptorová tyrosin kináza zapojená v přenosu signálů z ECM WB Cadheriny Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cateniny WB, FM g-catenin Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cadheriny WB connexin 43 Složka gap junctions (GJIC) WB GJIC inhibition assay Testování funkčnosti GJIC pomocí luciferové žluti FM Wound healing assay Testování motility buněk FM cytopl. fosfolipáza A2 Odštěpuje AA z membrán WB 5-lipooxygenáza Metabolizuje AA na leukotrieny WB Cyklooxygenáza 2 Metabolizuje AA na prostaglandiny, prostacykliny a tromboxany WB Uvolňování AA Uvolnění AA z buněk do media HPLC (VUVEL) Signální dráhy receptorů smrti LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Kinázy a proteiny s nimi asociované Fas-L Ligand Fas-R - signál smrti WB Fas-R (CD95) Receptor smrti - aktivovaný navázáním Fas-L WB,FACS FADD Adaptérová molekula - součást DISC komplexu WB Toso Inhibitor Fas indukované apoptózy nacházející se na povrchu T lymfocytů WB TRAIL Ligand TRAIL-R - signál smrti WB TRAIL-R1,2 (DRs) Receptory smrti - aktivovány navázáním TRAIL-L WB,FACS TRAIL-R3,4 (DcRs) Decoy receptory - vážou TRAIL, ale neaktivují proces apoptózy WB,FACS Ras, N-Ras Mebránový G-protein WB ERK 1/2 Imunochemické stanovení neaktivní a aktivní (fosforylované formy) WB p38 Imunochemické stanovení totální (na fosforylačním stavu nezávislé) hladiny p38 WB JNK/SAPK activity assay stanovení aktivity analýzou fosforylace substrátu (radioizotopová metoda) RG Akt/PKB Serin/Threoninová protein kináza, může stimulovat Ras WB pTyr Protilátka detekující fosforylovaný Tyrosin WB pSer Protilátka detekující fosforylovaný Serin WB Signální dráha TGFb LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Proteiny asociované s AhR AhR WB, RT-PCR Ligand-dependentní transkripční faktor, EMSA, FM Reporter gene assay for AhR Metoda stanovení aktivity Ah R LM Stabilní transfekce mutantních variant AhR a ARNT pomocí plazmidových vektorů ARNT Jaderný partner receptoru AhR umožňující jeho vazbu na XRE element WB, RT- PCR CYP1A1 Oxidáza se smíšenou funkcí patřící do rodiny cytochromů P450 WB, RT- PCR TGF b1 Růstový faktor WB TGF b R I, II Receptor pro TGF b WB Smad 2, 4 Aktivace TGF R vede k translokaci těchto transkripčních faktorů do jádra WB Proteiny spojené s hormonální regulací LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly Transkripční faktory a asociované proteiny ER a, b Receptory estrogenů WB Reporter gene assay for ER Metoda stanovení aktivity estrogenních receptorů LM Cathepsin D Endopeptidáza indukovaná estrogeny WB LRP/MVP Ribonukleoproteinové částice ovlivněné hladinou estrogenů WB PPARg Jaderný receptor pro hormony ovlivňovaný MAPK WB NF-kB Aktivátor řady genů spojených s hematopoezou, apoptózou atd. WB, EMSA IkB Inhibitor NF-kB, který jej zadržuje v cytoplazmě WB c-Myc Po navázání heterodimerizačního partnera Max působí jako TF WB p53 Onkosupresor podílící se na řízení oprav DNA lézí WB AP - 1 (Jun + Fos) Homo- či heterodimerní transkripční faktor WB, EMSA Informativní seznámení s FCM (jedna z klíčových metod výzkumu in vitro: Naznačení možností !!!!) Viz dále K. Souček et al.– Moderní metody…. FACS ARIA SORP II FACSCalibur KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEICA Partec PASPartec CCA 2 The Flowcytometers – (short introduction) - a sophisticated product family equipped with the most advanced technologies available. High performance, high speed cell sorter FACSDiVa (Vantage) Flow sorting instrument for the research laboratory FACSCalibur The FACSCalibur is the first a 4-colour, dual laser, benchtop system capable of both cell analysis and sorting fully integrated multiparameter system, wide range of research and clinical applications It has combined benchtop easy-of-use with the flexibility and performance of high-end flow cytometers Building on the easy-of-use standard set by the FACSCalibur, the BD LSR offers software instrument Control, push button fluids, and fine-adjust sample flow-rate control 3 BD – since 1974 BD has been the leading provider -recent models of innovative technology in flow cytometry BD LSR - the first 6-Color Benchtop Research Flow Cytometer Beckman Coulter Instruments (are Analogical to those of Becton Dickinson) Cytomics FC 500 Series Flow cytometry system COULTER EPICS XL-MCL EPICS ALTRA with HyperSort Cell Sorting 4 FACSCalibur 5 6 What is the Flow cytometry histochemistry in flow BASICS of FLOW CYTOMETRY Represent: ELECTRONICS OPTICS FLUIDS 7 Flow Cell - Mechanism Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Purdue University Cytometry Laboratories Flow Chamber Cells in single file flow through an illuminated volume where they scatter light and emit fluorescence converted to digital values as it pass through a small 50-300 micrometers orrific In most instruments this (laminar flow) is accomplished by injecting sample into a sheath fluid that are stored on a computer are collected, filtered 1 2 The speed of flowing cells Optimum for immunophenotyping: 1000 cells/s Optimum for DNA analysis: 200-300 cells/s 8 …need to have cells in suspension !!! CELL INTERACTION OF LIGHT WITH THE CELL Fluorescence is emitted, and light scattered, in all directions. THE AMOUNT OF LIGHT SCATTERED AT LARGE ANGLES (15 - 150°) INCREASES WITH CELLS’ INTERNAL GRANULARITY AND SURFACE ROUGHNESS IS GENERALLY PROPORTIONAL TO THE AMOUNT(S) OF INTRINSIC AND/OR EXTRINSIC FLUORESCENT MATERIAL(S) IN OR ON A CELL EXTINCTION, I. E., THE LIGHT LOSS FROM THE INCIDENT BEAM, REPRESENTS THE SUM OF LIGHT ABSORBED AND LIGH SCATTERED BY THE CELL THE AMOUNT OF LIGHT SCATTERED AT SMALL ANGLES (0.5 - 5°) GIVES A ROUGH MEASURE OF CELL SIZE but is affected by other factors, such as refractive index INCIDENT LIGHT BEAM 11 THE AMOUNT OF FLUORESCENCE EMITTED MUST BE LESS THAN THE AMOUNT OF LIGHT ABSORBED, AND How Forward Angle Light Scatter is collected FALS Sensor Laser Purdue University Cytometry 9 The amount of light scattered in the Forward direction (along the same axis That the laser light is traveling) is detected in the forward scatter channel The intensity of forward scatter is proportional to the Size Shape (tvar) Optical homogenity of cells (or other particles) When a laser light source is used 10 How is collected The intensity of side scatter is proportional to the Size Shape Optical homogenity of cells (or other particles) When a laser light source is used the amount of light scattered to the side (perpendicular to the axis that the laser light is traveling) is detected in the side or 90° scatter channel 1 12 (Summary) 13 (Definitions) Fluorescence detection in the flow cell 90 Degree Light Scatter 14 (transmit wavelengths above a cut-on wavelength) (transmit wavelengths belov a cut-off wavelength) are constructed from materials that absorb certain wavelenghths Optical filters (while transmitt others) 15 16 17 PMT PMT PMT PMT Dichroic Filters Bandpass Filters „Rozmístění“ Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry Laser 1 2 3 4 Flow cell original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Design of multiple channel layout must consider spectral properties of fluorochromes being used and proper order of filters and mirrors – optical elements providig separation of channels and wavelength selectio (photomultiplier tube Detectors 18 Data Acquisition - ListmodeData Acquisition - Listmode Event Param1 FS Param2 SS Param3 FITC Param4 PE 1 50 100 80 90 2 55 110 150 95 3 110 60 80 30 © Karel Souček 2000  Detected Data are collected as a “list” of values, for particular “event” (cell) and particular“parameter” Every „eventes and “parameters” are evaluated using computers 19 DNA Analysis - Information: Detection of • DNA ploidy • cell cycle distribution Useful for: • diagnosis and prognosis of cancer • the effects of cytotoxic and cytostatic drugs • research – on the level of cell and molecular biology experimental and clinical oncology The most frequently measured FCM parameters are - DNA content and - immunophenotyping 20 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2M DNA Analysis DNA Content - Fluorescence Intensity C o u n t 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst - 7-AAD Channel Number 21 Acquisition and analysis Important: • sample preparation and machine adjustment • density of the samples (1mil./ml) • number of cells measured – minimum 10 000 (without debris and aggregates) • gating of special part of cell population Cell cycle analysis - special softwares 22 Cell-Quest allows different types of data presentation dot plot contour plotdensity plot histogram 3D plot R1 23 ModFiT 3.0 software for cell cycle analysis 24 Models for S-phase evaluation ModFiT 3.0 (Verity Software House, Inc.) ModFit Edit -> Configuration -> S-Phase psw- OmegaRSC - 1.98 Rectangle (Obdelníkový) Trapezoid (Lichoběžníkovitý) polynomial 25 control Cell cycle changes after various types of treatment sodium butyrate (arrest in G0/G1) cycloheximide (arrest in G2/M) fluorouracil (arrest in S-phase) esculetin (changes in S-phase) arachidonic acid + butyrate (apoptosis) Annexin V detection R1 R2 File: CHX_ 50 /5 h-ANX-FITC/PI Quad % To tal UL 1 .42 UR 2 9.1 1 LL 5 8.4 3 LR 1 1.0 4 File: K-ANX-FITC/PI Quad % To tal UL 0 .21 UR 2 1.3 9 LL 7 0.1 7 LR 8 .23 © Karel Souček 2000 PI Annexin – x - axis Early apoptosis Control cycloheximide Living cells 27 PLAMA MEMBRANE Halogenated precursor of DNA: • Incorporation into DNA during replication (S phase) • Imunohistochemically detected (monoclonal antibody). • Continual BrdU staining – detection of all proliferating cells – estimation of proliferating fraction • Pulse staining – cell cycle kinetics, duration of cell cycle phases (TG1, TS, TG2/M) and potential doubling time (Tpot). 5-bromo-2´- deoxyuridine (BrdU) 28 Two-parametric analysis of cell cycle 7-ADD/BrdU (human keratinocytes HaCaT) control esculetin 48h (S-phase arrest) NDGA 48h 7-ADD BrdU 29 I. CELL CULTURES: Suspense or adherent cells (trypsinisation neccessary) Staining in suspension (optimal density106 cells /ml, single-cell suspension neccessary!!!) Possibilities for DNA analysis: • after detergent treatment (Triton X, Nonidet) – cell nuclei • after fixation, i. e. ethanol (long storing in 4 0C) • fluorochromes binding to both DNA and RNA - use of RNase Possibilities for other type of analyses Apropriate staining for simultaneous detection of expression of cell surface antigens or intracellular molecules (cyclins, p53, p21, bcl-2....) , ROS etc. According to SPECIAL PROTOCOLS PREPARATION OF SAMPLES 30 PREPARATION OF SAMPLES II. TISSUES • Adequate single-cell suspension neccessary!!! • Appropriate methods for specimen handling depend on the cell parameter measured and tissue type. Single-cell suspension of whole cells can be prepared from: • Fresh tissue - mechanical or enzymatic disaggregation necessary • Fine-needle aspirates, bone marrow aspirates, pleural, ascitic or other fluids. Cell suspension can be fixed, used for cytospin preparations, frozen etc. Intact nuclei can be prepared from: • fresh or frozen tissues • paraffin-embedded tissues (debris removed by a sucrose step gradient) 31 Side Scatter Projection ForwardScatterProjection Scale Side Scatter 0 200 400 600 800 1000 ForwardScatter 02004006008001000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection ForwardScatterProjection Light Scatter Gating Scale Purdue University Cytometry Laboratories Whole blood sample („Wash and lysed protocol“) 32 Mitochondrial membrane potential JC-1 Merocyanine 540 NIH 3T3 © Karel Souček 2000 aggregates monomers Decreased mitochondrial potential (death cells) rial Nomal Treatment with valinomycin 33 Control ATRA DMSO NaBt vit. D3 0.02% 0.17% 0.14% 0.02% 0.37% 11.9% 0.14% 0.8%0.8% 12.2% 49.3% 1.7%0.04% 16.6% 57.9%4.8% FITC FITC FITC CELLULAR ANTIGENS © Karel Souček 2000 Two-parametric analysis of cell surface antigens (HL-60 human leukemic cells treated with agents of differentiation) CD11b (granulocyte/ monocyte marker) CD14 (monocytic marker) 34 CD 14 CD 11b oxidative matablolism products - markers of diffrentiation 36 Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-1 © Karel Souček 2000 35 PARAMETERS MEASURED BY FLOWCYTOMETRY (have not been mentioned) PARAMETER MEASUREMENT METHOD AND PROBE IF USED Intrinsic Structural Parameters (no probe) Cell size Extinction or small angle light scattering, electronic impendance (DC) Cell shape……………………….. Pulse shape analysis Cytoplasmatic granularity Large angle light scattering, electronic impendance (AC) (other,e.g., of eosinophyl granules)…Polarized light scattering Pigment content (e.g., hemoglobin, Absorption, fluorescence, multiangle scattering photosynthetic pigments, porphyrins) Protein fluorescence…………….. Fluorescence (tryptophan, tyrosine) Intrinsic Functional Parameter (no probe) Redox state Fluorescence (endogenous pyridine and flavin nucleotides) 37 PARAMETER MEASUREMENT METHOD AND PROBE IF USED Extrinsic Structural Parameters DNA content Fluorescence (e.g., propidium, DAPI) DNA base ratio ……………………….. Fluorescence (A-T and G-C preference dyes; e.g., Hoechst 33342 and chromomycin A3 , cyanine/styryl dyes) Nucleic acid sequence ………………… Fluorescence (labeled oligonucleotides) Chromatin structure Fluorescence (fluorochromes after DNA denaturation) RNA content (single and double-stranded)…………. .. Fluorescence (e.g., acridine orange, pyronin Y, thiazole orange) Total protein Fluorescence (covalent or ionic bonded acid dyes) Basic protein……………………………. Fluorescence (acid dyes at high pH) Antigens Fluorescence (labeled antibodies), scattering (dye  gold labels) Lipids Fluorescence (e.g., Nile red) Surface sugars (lectin binding sites) Fluorescence (labeled lectins) PARAMETERS MEASURED BY FLOWCYTOMETRY OTHER PARAMETERS 38 Surface receptors Fluorescence (labeled ligands) Surface charge Fluorescence (labeled polyionic molecules) Membrane integrity (“viability“)……………………. Absorption or scattering (e.g., trypan blue) Fluorescence (e.g., propidium, fluorescein diacetate (FDA) Membrane fusion/turnover………………………… Fluorescence (labeled long chain fatty acid derivates) Membrane organization Fluorescence (e.g., merocyanine 540) Membrane fluidity or microviscosity Fluorescence polarization (DPH) Mebrane permeability……………………………….. Fluorescence (e.g., Hoechst 33342, rhodamine 123, (dye/drug uptake/efflux) cyanines, anthracyclines) Endocytosis Fluorescence (e.g., labeled beads or bacteria) Intracellular receptors………………………………. Fluorescence (labeled ligands) Cytoskeletal organization Fluorescence (e.g., NBD- phallacidin) Enzyme activity Absorption or scattering (chromogenic substrates) Fluorescence (fluorogenic substrates) Oxidative metabolism ……………………………… Fluorescence (e.g., dichlorofluorescein) Sulfhydryl groups / glutathione Fluorescence (e.g., monochlorobimane) DNA synthesis Fluorescence (anti-BrUdR antibodies; dye mixtures; SBIP) DNA degradation (as in apoptosis)…………………. Fluorescence ( labeled nucleotides) “ Structuredness of cytoplasmic matrix “ Fluorescence polarization (FDA) Cytoplasmic/mitochondrial membrane potential Fluorescence (e.g., cyanines, oxonols, rhodamine 123) “Membrane/bound“ [Ca ++]………………………… Fluorescence ( chlortetracycline) Cytoplasmic [Ca ++] Fluorescence ratio (e.g., indo-1); fluorescence (e.g., fluo-3) Intracellular pH Fluorescence ratio (e.g., ABD, BCECF, SNAFL, SNARF) Extrinsic Structural Parameters PARAMETER MEASUREMENT METHOD AND PROBE IF USED 39 40 FLOW CYTOMETRY (FCM) Main Disadvantage Main Advantages FCM allows understanding of COMPLEX CELLULAR PROCESSES in relatively advantageous proportion as to the yield of information on the level of individual cell compared to large population Apart from this fact flowcytometry represents relatively INEXPENSIVE AND FAST METHOD, which enables us to gain the basic information concerning the developmental tendencies of large cellular populations The considerable initial costs FCM has some limits in special applications eg. tissue analyses WE ALWAYS RECOMMEND THE COMPARISON WITH OTHER RELEVANT APPROACHES USE CELL CULTURES IF POSSIBLE Using multiparametric analyses FCM provides considerable amount of both qualitative and quantitative data with high bioindicative potential. 41