Konjugace Přenos DNA zprostředkovaný konjugativními plazmidy Donor - recipient > transkonjugant (Exkonjuganti - v rámci téhož druhu, transkonjuganti - v rámci různých druhů) Přenášené typy elementů (DNA): - Samopřenositelné (self-transmissible) plazmidy - Mobilizovatelné plazmidy - Chromozómová DNA - Konjugativní transpozony (+mobilizovatelné transpozony) Pokus s U-trubicí: důkaz, zda je pro přenos genů nutný kontakt buněk Davies, 1950 Filtrem nemohou procházet bakterie, ale viry a DNA ano Charakteristické rysy konjugace 1. Jednosměrný přenos plazmidů, jednosměrný/obousměrný přenos chromozómových markerů 2. Je přenášen jen konjugativní plazmid, nebo dochází k mobilizaci dalších elementů (plazmidů, transpozonů, chromozomu) Výskyt konjugace u bakterií G- (enterobakterie) prototypem je konjugace zprostředkovaná F-plazmidem řada konjugativních R-plazmidů příbuzných F-plazmidu, mnoho jich má široké rozmezí hostitelů, např. RK2 (RP1, RP4) Další G-: Agrobacterium (Ti-plazmid), Pseudomonas, G+ (enterokoky, stafylokoky, streptokoky,streptomycety) prototypem je konjugace zprostředkovaná pAD1 mnoho plazmidů má široké rozmezí hostitelů FUNKČNÍ OBLASTI F-PLAZMIDU Transferová oblast '°°*p. Replice' Oblast IS sekvencí TraA - pilin TraQ - transport pilinu TraS, T - zábrana spojení F+ buněk (povrch.exkluz TraN,G - stabilizace párů TraY, Z - zlom v oriT TraD - průchod DNA membránou donora Vedoucí oblast Dtr component = „DNA transfer and replication Mpf component = „mating-pair formation" TRANSFEROVÁ OBLAST F plazmidu □ 33 kb. Oblast obsahuje veškerou genetickou informaci nezbytnou pro přenos. □ Geny lze podle funkce rozdělit do 5 skupin: 1. Biosyntéza a sestavování F pilusu (traA,B,C,E,F,G,H,L,K,Q,U,V,W) 2. Stabilizace párujících se buněk (traG,N) 3. Konjugativní metabolismus (traD,I,M,Y,Z) 4. Regulace přenosu (traJ,finO,finP) 5. Povrchová exkluze (traS, traT) □ TraT = vnější membránový protein zabraňující stabilnímu spojení buněk obsahujících plažmidy □ TraS = protein vnitřní membrány zabraňující vstupu DNA do buňky při náhodném spojení buněk s F PRŮBĚH PŘENOSU PLAZMIDOVÉ DNA PŘI KONJUGACI □ Stádia párování: a) Donorová buňka naváže kontakt s recipientní pomocí pilusu b) Následuje přibližování buněk depolymerizací pilusu (retrakce pilusu) c) Probíhá syntéza DNA d) Dochází k aktivní disagregaci donorových a recipientních buněk F + F- Typická buňka F+ má asi 20 pilusů - kontakt jedné donorové buňky s několika recipientními PRŮBĚH KONJUGATIVNÍHO PŘENOSU DNA 1. Dochází k jednořetězcovému zlomu v oriT v místě nic 2. Odmotávání DNA ve směru 5 ' - 3 ' 3. Přenos jednořetězcové DNA 5' koncem do recipienta 4. V donorové buňce je doreplikován komplementární řetězec replikací otáčivou kružnicí 5. V recipientu je komplementární řetězec dosyntetizován diskontinuálně 6. Cirkularizace DNA v recipientu Přenosový aparát F plazmidu sestavený z informací o funkci jeho složek Tra A (pilin) TraN, TraG Stabilizace párování TraB, TraK - tvoří pór, ►řichycený k membráně prostřednictvím TraV TraT, TraS Povrchová exkluze Inzerce pilinu do membrány, jeho acetylace um IM 5'konec DNA vázán na tyrozin Tral (relaxáza) RELAXOZOM TraY, TraM, Tral, IHF ZOM ľral, IHF Helikázová a relaxázová aktivita (hydrolýza ATP) Donor CM Recipient MPF structure — Coupling protein formation of mating pairs C Coupling protein signals to relaxase (oy% ) Relaxase7 Single-strand nick at oriT and strand displacement Strand transfer, closing of circle by relaxase, replication in recipient Donorová buňka vytváří pilus, kterým kontaktuje recipientní buňku. (povaha signálu není známa) Dochází k vytvoření póru mezi oběma buňkami Relaxáza aktivovaná „coupling" proteiny vytvoří zlom v oriT na DNA Relaxáza a DNA přecházejí do recipientní buňky, kde relaxáza DNA cirkularizuje Primáza (kódovaná plazmidem nebo chromozomem) zahájí syntézu komplementárního řetězce Dochází k separaci donorové buňky a transkonjuganta Donor Transconjugant INTERAKCE MÍSTA NIC S RELAXAZOU V MÍSTĚ oriT Oblast oriT (500 bp) Z —r AT+ nic (10 bp) í IR, DR Z Rozpoznání místa n/c relaxázou (místně specifická endonukleáza) 1 Relaxozom DNA + mob-proteiny Relaxační komplex OriT lze vložit do libovolného plazmidu, který je pak přenesen jako F PŮSOBENÍ RELAXÁZY PŘI PŘENOSU PLAZMIDU KONJUGACÍ Relaxáza vytvoří zlom v místě oriT, 5 ' fosfát je z DNA přenesen transesterifikační reakcí na tyrozinový zbytek relaxázy Relaxáza vstupuje do recipientní buňky a vtahuje do ní i jednořetězcovou DNA od 5'konce Zpětnou transesterifikační reakcí je fosfát přenesen na 3'OH konec přenesené DNA, čímž se tato recirkularizuje a relaxáza se uvolní Přenos F-plazmidu z buňky F+ do buňky F- donorová buňka F+ recipientni buňka F" Siř O F-pi!usy tionorové bjňfcy F* navozují kontakt s recipientnimi buňkami F" a přitahují buňky k soba. Syntézu konjugačního můstku Fidí geny přítomné na F-faktoru. V počátku replikace F-faktoru je jeden řetězec DNAétépen. konjugační můstek vytváří mezi buňkami kanál Jeden řetězec F-faklom je mechanizmem otáčející se knižnice přenášen do recipientni buňky. Béhem přenosu probíhá v obou buňkách replikace F-faktoru (v každé buňce je syntetizován jeden 9 Přenos F-faktoru je dokončen, vznikají dvé bakterie F+ Pore(traYZ) Donor Konjugativní přenos F Helicasel (tral) relaxáza- multifunkční komplex T-řetězec ssb-proteiny Rezipient pnmaza Donor conjugal DNA synthesis (DCDS) - náhradová syntéza DNA v donorové buňce mechanismem otáčející se kružnice Repliconation - syntéza komplementárního řetězce v recipientní buňce ■4-1 artA M i—> \©_ J YALEKBPVCWUN trbC trbDtrbE FA Q trbB trbF H G S T D —> i--:--- ■e US3I I Z finO' 'finO -> Genetická regulace tra-operonu Je řízena dvěma regulačními okruhy: 1. Produkty genů finO a finP regulují expresi genu tra J negativně 2. Produkt genu traj reguluje expresi genu traM a operonu traYZ pozitivně. U F plazmidu je gen finO inaktivován IS3a. Produkty genů finO a finP reprimují transkripci genů tra. Zatímco gen fínO kóduje protein, exprimuje gen fínP krátkou RNA (u F má délku 78 b). Gen fínP leží v oblastí genu traJ, je však transkribován v opačné orientaci. Přesný mechanismus zábrany exprese traJ není dosud znám. Pravděpodobně fínP-RNA zabraňuje transkripci nebo/a translaci genu traJ. Protein FinO působí buď společně s FinP-RNA, nebo nezávisle na ní. K represi jsou však zapotřebí v každém případě oba produkty. A Genetic organization of tra region mRNA traf traY oriT traM traj traY traX finO Antisense RNA finP B Immediately after entry into cell A T Nově vzniklý konjugant přenáší plazmid do dalších buněk s vysokou účinností Activates P MY Pili and transfer functions _A_ oriT traM tra) traY traX finO C After plasmid establishment Po ustavení plazmidu v buňce se I FinP blocks translation: no Traj exprimují všechny plazmidové geny a r^^ííC^ J plazmid se přenáší při nízké frekvenci oriT traM traj traY traX finO FinP (FinO] FinO stabilizes FinP Inhibice fertility finO = negativni regulator — represor HnP = negativnf regulator — antisense RNA F = drd = derepressed mutant plasmid Charakter buněk F-, F+ a Hfr buňkaF" buňkaF+ začleněný F-faktor buňkaHfr autonomní chromozom F-faktor chromozom chromozom Vznik buněk Hfr začlenením F do chromozomu Buňka F* i Plazmĺd F vešiavu Hfr Buňka Hfr ZPŮSOBY ZAČLENĚNI F PLAZMIDU DO CHROMOZOMU integrace nezávislá na RecA transpozice F-Faktor Chromosom j Transposase \ I I IS Element ► oril integrace závislá na RecA homologní rekombinace Q: F-Faktor Chromosom RecA-Protein im ĽD IS-Element ► eriT v chromozomu se objeví nová IS Vznik buňky Hfr (HfrH) začleněním F-plazmidu do chromozomu E. coli Vznik kmenů Hfr začleněním F plazmidů do různých míst chromozomu E. coli. Začlenění probíhá v místech IS. a Hfr-KmenI Hfr-Kmen II Hfr-Kmen IN' Hfr-Kmen IV Obr. 64. Mechanismus vzniku řízných typii Hfr-kmenů (viz text) Místa začlenění F-plazmidu do chromozomu E. coli TABULKA 3 5 P O Ř Á Ď T ; G E N O NA CHROMOZÓMU NĚKTERÝCH KMENŮ Hfr. Podle Stenta (1971) Kmen Hfr HfrH Hfrl Hfr2 Hfr3 H£r4 . Hfr5 Hfr6 Hfr7 Pořadí přenosu genů O— thr—leu—azi—ťon—pro—lac—pur—gal—trp—his—gly~ str—mal—xjyl—míl—ile—met—thi O—leu—thr—thi—met—ile—mtl—xyl—mal—str—gly—his—trp—gal—pur—lac—pro—ton—azi O—pro—ton—azi—leu—thr—thi—met—ile—mtl—xyl—mal—str—gly—his—trp—gal—pur—lac O—pur—lac-^-pro—ton—azi—leu—thr—thi—met—ile—mtl—xyl—mal—str—gly—his—trp—gal O—thi—met—ile—mtl—xyl—mal—str—gly—his—trp—gal—pur—lac—pro—ton—azi—leu—thr O—met—thi—thr—leu—azi—ton—pro—lac—pur—gal—trp—his—gly—str—mal—xyl—mtl—ile O—ile—met—thi—thr-leu—azi—ton—pro—lac—pur—gal—trp—his—gly—str—mal—xyl—mtl O—ton—azi—leu—thr—thi—met—ile—mtl—xyl—mal—str—gly—his—trp—gal—pur—lac—pro Přenos genů probíhá v definovaném pořadí, může probíhat v obou směrech, a probíhá konstantní rychlostí 45 kb/minutu. Celý chromozom E. coli se přenese za 100 minut. Sledování frekvence rekombinant při použití různých kmenů Hfr F+ = Leu+ StrS F- = Leu- StrR Rekombinanty = Leu+ StrR IZOLACE KMENU HFR n i ri i i i Leu+StrS ii Ozáření suspenze buněk Ff UV světlem 2) Přeíivšíbuňky ::+se vysejí na kompletní půdu v íakovéíTi ředěnf.aby na plotně vyrostlo asi 300 kolonii' 3) Na minimální půdu se streptomycinem A) Kolonie buněk F+se přerazítkujf ' seňaočkuje čennvá kultura F"Leu"Strr na plotnu s nárůstem buněk F" ) Po 36 hodinách se obě plotny srovnávají Selektivní půda '■ [Minimální půda + streptomycin) Kompletní půda Místa na minimální půdě vyznačující se hustým nárůstem představují' rekombinanty Leu*S-trr, které vznikly konjugací buněk F" s'buňkami Hfr přenese- * nými na plotnu razítkem Křížení kmene F+ a F- DONOR Suspense buněk F+ ThrWBio"Merstrs Konjugační směs . RECIPIENT Suspense buněk F~ Thr-Leu"Bio+Met+Strr • — —~ —- • Rozsev na minimální Rozsev po 60 minutách Rozsev namínímáíní syntetickou půdu konjugace na minimální, syntetickou půdu se strepíomycinem syntetickou pudu se se streptomycinem 1 streptomycinem i Kolonie rekombinantních transkonjuyantů Thr+Leu+Bio+Met+Strr Za vznik rekombinantu jsou zodpovědné buňky Hfr Křížení kmenů F+x F" Populace buněk F+ buňky F" F+ Hfr 104 1. V populaci buněk F+ je nízká proporce buněk Hfr, v nichž je F-plazmid začleněn do různých míst chromozomu 2. Volný F-plazmid se přenáší do F- buněk za vzniku buněk F+ 3. Z buněk Hfr se přenáší část chromozomu do F- buněk za vzniku rekombinant 4. Dochází k superinfekci rekombinant F plazmidem, v důsledku čehož výsledné rekombinanty obsahují F-plazmid Kin etika přenosu markerů při přerušované a nepřerušován konjugaci;.....nepřerušovaná k.,-------přerušovaná k. °3 10 strS 20 30 ^0 v Ca$(v minutách) 50 Po přenosu do recipientní buňky mají všechny geny stejnou pravděpodobnost začlenění do chromozomu (vyjma prvních 1-2') Geny přenášené jako první (vysoká pravděpodobnost přenosu) Geny přenášené později (nízká pravděpodobnost přenosu) Křivky vycházejí ze sledování průběhu konjugace v populaci gal Geny, které se nezačlení Výsledky a interpretace pokusu s přerušovanou konjugací shrnutí výsledků interpretace výsledků počátek přenosu azř torr Iac+ gaf J&i_ o 9 11 18 25 doba přenosu (minuty) (b) Místa začlenění F-plazmidu do chromozomu E. coli Konkrétni přiklad nepřerušované konjugace Křížem: HfiH Leu+Pro+Lac+Gal+Trp+Strs x FI^uTroXac GaTTrp-Stť Selekce jednotlivých kategorií rekombinantů se provede na minimální půdě se streptomycinem a doplněné takto: Donorové a re-cipientní buňky se smíchají, inkubují 60 minut a vysejí na plotny rek QMEiN Ajvn Půda FREKVENCE REKOMBINANTŮ 1. Leu^Sť : + pro, glu, trp 2. Pro+Strr : + leu, glu, try 3. Lao+Strr : + leu, pro, lak, trp 4. GafStť" : + leu, pro,gal,trp 5. Trp^tr : + leu, pro, glu 0,20 0,15 0,13 0,078 0,044 FREKVENCE REKOMBINANTŮ = počet rekombinantů daného typu počet buněk Hfr Odvozené pořadí genů na chromozomu kmene HfrH: O-Ieu-pro-lac-gal-trp Křížení přerušovanou konjugací buňka híí h buňka F" Charakteristika přenosu: 1. Přenos začíná od oriT na F-plazmidu 2. Chromozomální geny jsou přenášeny v lineárním pořadí od oriT 3. Doba přenosu genů je úměrná jejich vzdálenosti od oriT 4. Pravděpodobnost přenosu genů klesá s jejich vzdáleností od oriT 5. Pravděpodobnost začlenění genů přenesených z donora do chromozomu recipienta je pro všechny geny stejná Q 25 minut po zahájení klíženi. Bakteriální chromo2otn { Rekombinace F Plasmid typ i ÍLjpU I Hxcize iypu II F'pla^mid — Densfurace typ II Renaiurace s F r Meleroduplex se subsíiiucnf smyčkou F plasmid Vznik plazmidů F' typ I (IA n. IB) - plazmid obsahuje distální nebo proximální část bakteriálního chromozomu typ II - plazmid obsahuje proximální i distální část bakteriálního chromozomu Podíl chromozómové DNA v F'plazmidu může činit až 30% Heieroduplex s de teční smyčkou Vznik plazmidů F' A B C D Typ IA Typ IB Typ II □ IS-Element ► oriT v chromozomu zůstává část F plazmidu Sex factor affinity VZNIK F PLAZMIDU HOMOLOGNI REKOMBINACI MEZI IDENTICKÝMI IS ELEMENTY E. coli chromosome IS 7 IS2 E. coli chromosome T IS2 IS? Různá konstituce a velikost F'plazmidö F' factor carrying chromosomal genes SELEKCE F PLAZMIDŮ NA ZAKLADE ČASNÉHO PŘENOSU pozdního MARKERU A. Kmen Hfr přenášející gen pro jako pozdní marker. Při křížení s kmenem F- bude gen pro přenášen zhruba po 60 minutách. B. Vznik F'plazmidů se začleněným genem pro. Při křížení s kmenem F-bude F 'pro přenesen během 5 minut. Výsledný zdánlivě rekombinantní kmen bude schopen gen pro dále přenášet při vysoké frekvenci Další možnost: použití recipienta recA" F" Pro+ apparent recombinant VZNIK DRUHOTNÝCH KMENŮ F' Prvotní kmen F Přenos F'lac do F Přechod do stavu Hfr (vysoká frekvence) Chová se jako Hfr Druhotný kmen F' je diploidní pro HeterogenotF'iac/iac alelu prenesenou Iutermediární douor F'p|azmjdem V recipientu dochází s vysokou frekvencí k začleňovaní F'lac do chromozomu a nebo výmene alely nesené F' (pak zámena alel) Přenos chromozomu ZYGOTICKÁ INDUKCE DMAprofáqa a j ^ ,3C pro DNA profaga b Chrorr)02Ómy Kmene l Hfr R srůinym ;. umístěním profága DNA orofáaa c MOBILIZACE NEKONJUGATIVNICH PLAZMIDŮ DONACI - Nedochází k fyzickému kontaktu plazmidů nic = bom basis of mobility 90% Col+/F+ 5% C0I+/F- Mobilizace prostřednictvím příbuzných plazmidů nic pBR322 Delece ori T ► pBR327 Mobilizace plazmidů kondukcí - dochází k fyzickému kontaktu obou plazmidů chromozom Přenos kointegrátu Kointegrát DONOR Tvorba konjugačního páru RECIPIENT Rozklad kointegrátu (pX obsahuje transpozon) Donór Recipient. pX = plazmid nemobilizovatelný donací Salmonella: mají řadu svých plazmidů, často fin+. Po jejich odstranění se do salmonely vnesly F plazmidy. U S. typhimurium se F včleňuje jen do jednoho místa (místo sfa, jehož původ není znám) Pseudomonas: divergentní skupina druhů a kmenů, má řadu konjugačních systémů, samopřenositelných nebo mobilizovatelných. Plazmid FP2 může mobilizovat chromozom v jednom směru z jediného chromozómového místa. Byly popsány jiné plazmidy, mobilizující od jiných míst. Mechanismus mobilizace není znám. Konjugace u G+ bakterií Konjugační přenos je znám u mnoha rodů: Bacillus, Enterocococus, Lactococcus, Staphylococcus a Streptomyces. Podobně jako u G- bakterií mohou být plazmidy přenášeny i mezi rody a druhy. Model konjugativního přenosu plazmidů u Streptococcus faecal is Donorová buňka Vazebná substance cOB1 Vazba na recipientní buňku poi Geny kódující sex-feromony Regulátorový gen, jehož produkt inaktivuje endogen Regulátorový gen, jehož produkt řídí tvorbu agregační substance FEROMON Recipientní buňka sex-feromony streptokoků Plasmid GroBe (kb) Sex-Phercxnon pADl 59,6 CAD1 • pOBl 71 * COB1 PPD1 I 54 CPD1 PAH7I \ 60 CAM7I pAHy2 - 60 CAH72 pAHy3 - 60 CAH73 pAH373 36 CAH373 pCFlO + 54 CCF10 * Jeden kmen muže tvořit více druhů feromonů a získávat tak různé plazmidy. * Plazmidy nesou geny pro tvorbu virulenčních faktorů a rezistence k antibiotikům * Plazmidy mohou být přenášeny do jiných druhů bakterií (Staphylococcus) Recipient cell A. Recipientní buňka tvoří feromony: geny pro feromony jsou umístěny na chromozomu. Feromony vznikají odštěpením signálních sekvencí z proferomonů při jejich exportu z buňky. „Quorum sensing" B. Donorová buňka: nese plazmid exprimující protein TraA (represor), který reprimuje transkripci tra genů vyjma traC, který kóduje povrchový protein TraC (receptor) zachytávající feromon. C. Indukce párování. Feromon se váže na TraC na povrchu donora a vstupuje do buňky, kde se váže na represor TraA, tím jej inaktivuje a navozuje tvorbu TraE, který pak aktivuje expresi tra genů včetně genu asa kódujícího agregační substanci (Asa) Donor cell Recipient cell D. Prenos plazmidu. Donorová a recipientní buňka navážou kontakt a plazmid se přenese za vzniku transkonjuganta. E. V recipientní buňce (transkonjugantu) se přestává vytvářet zralý feromon. Inhibitorový peptid iADl se váže na TraC a zabraňuje párování dvou donorových buněk. TraB je inhibitorový protein, který brání exkreci feromonu. Mechanismy zábrany příjmu homologního plazmidu: 1. Tvorba povrchových proteinů - exkluze vstupu 2. Tvorba peptidů (iADl) zabraňujících vazbě feromonu 3. Tvorba proteinů (TraB) - zábrana úpravy proferomonu a jeho exkrece KONJUGACE U STREPTOMYCET B Development of a streptomycete colony including plasmid mediated conjugation. (A) Streptomycete spores. The chromosome is shown by gold fines. The chromosomes are linear, but the ends may be held together (see Box 1.1). The small dots indicate a conjugative plasmid such as the multicopy plJlOI. (B) Germinating spore. Hyphae begin to form when spores germinate, (C) A growing colony. Growing branching hyphae form so-called "substrate" mycelia. Growing hyphae contain very few cross walls, and so chromosomes (not shown) are not separated into individual compartments. During the transition from panel B to panel C, hyphal fusions may have occurred, allowing an opportunity for recombination between chromosomes from different parents. (D) Sporulat-ing mycelia. The vertically directed "aerial" hyphae have differentiated, forming chains of spores. As shown in panel D', the spores are haploid. A small percentage of the genomes will be recombinant, composed of segments of the different parental chromosomes (recombinants not shown). SPECIFICKÉ RYSY KONJUGATIVNIHO PŘENOSU U STREPTOMYCET □ Konjugace nevyžaduje plazmidově-kódované geny pro kontakt buněk (hyf) □ Není známo, zda přenos plazmidů nebo chromozmové DNA vyžaduje jednořetězcový zlom, a zda se přenáší jednořetězec □ Chromozomy se přenášejí obousměrně, aniž v nich je plazmid začleněn: není pozorován gradient přenosu chromozómových genu □ Plazmid pIJlOl kóduje jen jeden Tra-protein, který asi napomáhá přenosu DNA mezi hyfy. Po přenosu se plazmid velmi rychle v hyfech šíří. Letální zygoza - inhibice růstu recipientních buněk, do nichž byl konjugací přenesen plazmid - v okolí kolonie tvořené donorovou buňkou vznikají nas nárůstu recipientních buněk poky (pocks)