RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉ DNA
Kmeny E. coli K a K(P1) + mají vzájemně odlišnou hostitelskou
specifitu (K a P1) = obsahují odlišné RM-systémy
po jednom cyklu
Experimentální důkaz přítomnosti a působení RM systémů
Kmen E. coli
obsahující RM
systém EcoB
Kmen E. coli
obsahující RM
systém EcoK
RESTRIKČNĚ-MODIFIKAČNÍ (RM) SYSTÉMY
Složkami standardního restrikčně-modifikačního
(RM) systému jsou sekvenčně specifické
enzymy:
A. modifikační metyláza (metyltransferáza)
B. restrikční endonukleáza
Restrikci a modifikaci podléhá jen dsDNA:
1. Při infekci fágem
2. Při přenosech DNA transdukcí a konjugací,
omezeně transformací (při umělé tr.)
N6mA
C5mC
N6mA
Donor
metylové
skupiny:
SAM
(AdoMet)
SYSTÉMY RESTRIKCE A METYLACE
1. Hsd systémy (host specificity of DNA)
třídy (typy) I, II, III, IV
restrikční a metylační aktivita
2. Systémy restrikce modifikované DNA
Mar, Mrr (methylated-adenine), DpnI
Mcr (methylated-cytosine)
3. Systémy metylující specifické sekvence DNA
Dam (adenine-methylation)
Dcm (cytosine-methylation)
95%
1-2 geny,
30
protein štěpí
jen modifikovanou
DNA
GENY KÓDUJÍCÍ RM-SYSTÉMY JSOU NESENY
NA RŮZNÝCH REPLIKONECH
lokalizace genů na chromozomu,
plazmidech, nebo profágách
xbaI Xanthomonas campestris
M.Vch0211 Vibrio cholera
hphI Vibrio metschnikovii
CAA68 Lactococcus lactis
Integron
Rle39BITranspozon
Sth368I Streptocvoccus thermophilus
hsdMS S. aureus
Integrační komulativní
element/genomický ostrov
hindIII H. influenzae
sau42I S. aureus
ecoO1091 E. coli
bsuMI B. subtilis
Bakteriofág/profág
paeR71 P. aeruginosa
ecoRI E. coli
ssoII Shigella sonnei
bsp6I Bacillus sp.
Plazmid
Příklad RM systémuMobilní element
Přítomnost genů RM systémů na mobilních elementech
Klasifikace RM-systémů
PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍ
ENZYMOVÉHO KOMPLEXU
TYPU I
Multifunkční komplex
S = rozpoznání cílové sekvence
M = vazebné místo pro SAM a aktivní
místo pro metylaci
R = aktivní místo pro hydrolýzu ATP,
pro translokaci DNA a pro štěpení
Alosterický efektor
umožňující rozpoznání
cílové sekvence
SAM se
uvolňuje
před
štěpením
INTERAKCE ENZYMŮ RM SYSTÉMU TYPU I
S CÍLOVOU SEKVENCÍ NA DNA
1. Vyhledání rozpoznávací
sekvence
2. Podle stavu sekvence (M,
NM, H-M) dochází k
a) uvolnění enzymu
b) restrikci
c) metylaci
Interakce enzymového
komplexu s rozpoznávacím
místem
ATP-dependentní translokace DNA - ke štěpení dochází
po kolizi DNA řetězců v místě navázaného enzymu
štěpení
MODELY TRANSLOKACE DNA
ZPROSTŘEDKOVANÉ ENZYMY RM SYSTÉMŮ
TYPU I
Smyčky pozorované v EM
Navázaný restrikční
enzym
smyčka
TRD = target recognition domain
Pro RM systém typu I je
nezbytná funkční hsdS její
mutace vede
k fenotypu r- m-.
S- M-RMUTACE
V GENECH RM SYSTÉMU
r+/-/m-
RM SYSTÉMY, U NICHŽ JE ŠTĚPENA MODIFIKOVANÁ
DNA (KMEN NETVOŘÍ METYLÁZU)
E. coli K12
Mar = methyladenine restriction (GmeAC, GmeAG)
Mrr = methyladenine recognition and restriction
Mcr = methylcytosine restriction - modified
cytosine restriction (GmeCG - C5, N4, HM-C5) štěpení
sekvence v několika místech (štěpí též
neglukozylovanou fágovou DNA)
Diplocooccus (Streptococcus) pneumoniae:
RM systém DpnI - štěpí GmACT
(Caulobacter, Neisseria, Acholeplasma, Streptomyces)
Kóduje místně
specifickou
metylázu
Na úrovni
populace
Standardní
RM systém
Fág MU - konverze adeninu na A-(1-acetamido)adenin
Plazmidy: Ard (alleviation of restriction) - antirestrikční
protein
Fág lambda: Ral (restriction alleviation) - antirestrikční
protein - zvýšení modifikační aktivity enzymů typuAI na
NM DNA
Fágy T3 a T7: (proteiny Ocr = overcoming restriction)
inaktivace enzymů typu I (zábrana jejich vazby na DNA)
Fág P1: Dar-proteiny (defense against restriction) ? rozklad
SAM
Příklady antirestrikčních mechanismů
Ocr 0,3
Promotor genu ard
Lokalizace genu ocr/0,3 na
fágovém genomu
Lokalizace genu ard na
plazmidu
Antirestrikční
protein
Evoluce interakcí mezi T-sudými fágy a hostiteli
5-hydroxymetyl-
cytosin
The prr locus was originally described as
coding a ribonuclease that is activated
after phage T4 infection to cut within the
anticodon of a specific tRNA, inactivating
protein synthesis and thus blocking phage
development.
glykozylace hmC
SYSTÉMY METYLACE DNA (E. COLI K12)
1. Systém Dam (dam-metyláza)
metylace A v GATC (donor met = SAM)
GATC - regulační funkce : počátek replikace,
promotory, reparace
(sekvence GATC je rozpoznávána 15% RE typu
II, je přítomna u 50% všech 4N-RE, není však
cílovou sekvencí pro restriktázy v žádném z
druhů enterobaktérií.
2. DNA cytozin metylační - Dcm (E. coli K12)
metylace cytozinu na C5 v sekvenci CC(A/T)GG
(?funkce při reparaci na velmi krátké vzdálenosti)
VÝSKYT RM SYSTÉMU
U ENTEROBAKTERIÍ (3 DRUHY)
30% kmenů (z 1000 studovaných) obsahuje RM
systém
u 170 RM systémů bylo zjištěno jen 33 různých
cílových sekvencí
nebyly zjištěny RM systémy rozpoznávající 4 bpmísta
(včetně GATC)
VÝZNAM RESTRIKCE
Ochrana integrity vlastní DNA
obrana před bakteriofágy (typ II)
…dočasné působení, nutná obměna
Systém napomáhající rekombinaci cizorodé DNA
(typ I)
štěpení DNA (náhodně) mimo rozpoznávací sekvenci
umožní rekombinaci mnoha genů - analýza přenosu
genů transdukcí a konjugací podporuje vliv RM
systémů při vzniku mozaikových genomů (E. coli)
? „Selfish DNA“
molekulární paraziti bakterií. RM systému typu II se
udržují prostřednictvím plazmidů, které je kódují
(usmrcení bezplazmidových buněk)
RM systémy jako mechanismus postsegregačního zabíjení
restriktáza metyláza
"immigration control region"
Gen hsdS může být nahrazen genem
hsdS z jiného RM systému stejné třídy,
nebo geny mohou vzájemně
rekombinovat
Odlišný obsah GC
– indicie přenosu
HGT
VYUŽITÍ RM SYSTÉMŮ
V EUKARYOTICKÝCH BUŇKÁCH
Transgenní linie myších buněk exprimující geny RM
systémů
1. přenos a exprese genu M.PaeR7 (Pseudomonas
aeruginosa) - metyláza CTCGmeAG
2. přenos a exprese genu R.PaeR7 - endonukleáza
(restriktáza)
3. infekce buněk HSV1 adenoviry - očekávaná
rezistence buněk - vytvoření organizmu
rezistentního k virům (nebo jen určitých tkání)
Další možnost: studium vlivu metylace na genovou
expresi
Geny pro R a M bývají blízko sebe, ale ne
v transkripčních jednotkách
Konzervativní motiv