Histologické techniky v rostlinné embryologii Fixace Zalévání Krájení řezů Barvení řezů Histologie • původ názvu = z řečtiny: histos = tkáň logos = slovo, nauka • je vědní disciplína, která se zabývá studiem mikroskopické stavby živočišných tkání a rostlinných pletiv • používá speciální techniky přípravy preparátů a mikroskop Fixace • rozkladné autolytické procesy začínají prakticky ihned po smrti buněk a nenávratně ničí jejich původní strukturu • překonávají se fixací • první znalosti o fixaci živočišných tkání (samozřejmě ne pro mikroskopii) pocházejí již z dob Hippokratových používal sloučenin rtuti, byly známy i fixační účinky alkoholu • rozvoj fixace v pol. 19. století hlavně s rozvojem kožedělného průmyslu (různé sloučeniny, např. kyselina octová, alkohol, kyselina chromová, kyselina pikrová) • žádná metoda však nebyla jednoznačně optimální Fixace • zachování buněk a pletiv ve stavu co nejbližšímu k živému stavu • snížení strukturálních změn a změn chemického složení • strukturální proteiny a jiné sloučeniny se musí změnit na nerozpustné ve všech reagenciích, se kterými přijdou v průběhu celého procesu do styku • perfektní fixace = jen teoretická Fixace chemická – fixativa koagulující - koagulace cytoplazmatických proteinů ničí strukturu organel (např. mitochondrie) – fixativa nekoagulující - zachovávají organely (pro EM) Jednotlivá fixační činidla Etanol (metanol, aceton) • odstraňují vodu z bílkovin - štěpí vodíkové můstky a poškozují terciální strukturu = denaturace bílkovin • rozpustné proteiny = koagulované - poškození membrán • NK - nevysrážené, zůstávají rozpustné • neproniká rychle, způsobuje objemové zmenšování • v 96% ethanolu materiál křehne a tvrdne Kyselina octová • proniká rychle • koaguluje jaderný chromatin, ale plazmatické struktury poškozuje, mechanismus fixace je nejasný • pletiva zůstávají měkká - použití pro karyologická studia • někdy je nahrazována vyšším homologem = kyselinou propionovou, která nemá tak negativní účinky na cytoplazmu • 96% při 16,6°C „mrzne“ na hmotu podobnou ledu = její triviální název „ledová kyselina octová“ Kyselina pikrová = trinitrofenol • žluté jehlicovité krystaly - rozpustné ve vodě a alkoholu • v suchém stavu = třaskavina (uchovává se pod vodou) • koagulace proteinů je způsobena tvorbou solí - pikrátů • pikráty jsou rozpustné ve vodě - oplachování se musí provádět alkoholem a ne vodou! • dobře proniká do pletiv a zlepšuje jejich barvitelnost Formaldehyd • 1859 syntetizoval chemik Alexandr Butlerov • o 8 let později jej Hoffman potvrdil jeho definitivní chemickou strukturu • vzhledem ke složitosti syntézy jej histologové těžko užívali před těmito objevy • již koncem 19. století Luis Pasteur fixoval formaldehydem mozky lidí postižených vzteklinou • 1895 Ottův naučný slovník píše o užití formaldehydu v mikroskopii jako o nové metodě. Formaldehyd • je plyn s bodem varu -21°C • používá se jako – vodný roztok plynu (37- 40%) formalín nebo – pevný polymer - paraformaldehyd • během skladování se zhoršuje kvalita formalínu vlivem tzv. Canizariho reakce, kdy vzniká kyselina mravenčí = prudké snižování pH • po primární vazbě na různé funkční skupiny se vytvářejí křížové vazby („kroslinky“) - dochází k zesíťování molekul proteinů = nekoagulační fixace Glutaraldehyd • bezbarvá kapalina štiplavého zápachu • je toxický a způsobuje vážné podráždění očí, nosu, krku a plic, bolesti hlavy, ospalost a závratě – pracovat v digestoři, dodržovat zásady práce s toxickými látkami! • používá se samostatně nebo ve směsi s formaldehydem • zesíťování bílkovin pletiva po fixáži GA je mnohem pevnější - způsobuje větší tvrdost pletiv Kyselina chrómová • CrO3 • koaguluje hrubě proteiny a NK • dobře fixuje jádro, chromozómy fixuje výborně chemismus reakce není dobře známý • zlepšuje barvitelnost struktur • musí být dlouhodobě propírána po fixáži tekoucí vodou 24 - 48 hod.), aby se nevytvořil nerozpustný zelený hydroxid chromitý Oxid osmičelý • OsO4 • vysoce toxický, nutno dodržovat bezpečnostní pravidla • používá se jako postfixace po aldehydových fixacích • při zalévání do pryskyřice Obecný postup klasické histologické metody (parafínová metoda) • odběr materiálu • fixace vzorků • dehydratace • prosycení rozpouštědlem parafínu • prosycení parafínem • zalití do parafínu • řezání a lepení parafínových řezů • odparafínování řezů • barvení řezů • montáž (uzavírání) řezů Odběr materiálu • rychlý • pokud je nutná preparace – raději již ve fixáži • velikost vzorků přiměřená – pro rychlý průnik fixáže do celého objektu • volba segmentů podle plánovaného studia Fixační směsi – FAA (FPA) formaldehyde-acetic (propionic) acid – aethylalcohol • 50% nebo 70% ethanol 90 ml • ledová kyselina octová 5 ml • 37 – 40% formaldehyd 5 ml stálá rychle proniká vhodná pro studium anatomické stavby Carnoyova fixáž ethanol – chloroform - octová • 100% (96%) ethanol 60 ml • chloroform 30 ml • kyselina octová 10 ml proniká rychle - fixuje dobře chromatinové struktury použití v cytologických studiích – např. pro sledování jaderného dělení při vývoji pylu nebo zárodečného vaku Navašinova fixáž a CRAF • 1% CrO3 (kyselina chromová) 75 ml • ledová kyselina octová 5 ml • formaldehyd 37 – 40% 20 ml vhodná pro mladé orgány nutnost dlouhého vypírání v tekoucí vodě Sergej Gavrilovič Navašin (*14.12.1857 – †10.11.1930), ruský botanik. Působil jako profesor univerzity v Kyjevě, byl člen korespondent (od roku 1901), akademik Akademie věd v Rusku (od roku 1918) a Akademie věd v Ukrajině (od roku 1924). Zabýval se cytologií. V roce 1898 objevil princip dvojího oplození vyšších rostlin. Chromové fixáže (Sass 1951)  204265  destilovaná voda 1510105520formaldehyd 37-40%      5 ledová kyselina octová 35302010  10% kyselina octová     75 1% kyselina octová 504030202075 1% kyselina chromová VIVIIIIII CRAF Navašin Podle: Lux et al. 2002 Volba fixáží podle orgánů Lux et al. 2002 CRAF III, FAA, FPAStarší plody CRAF III, FAA, FPAMladé plody CRAF IIIEmbrya CARNOY, CRAF IIISemeníky CARNOY, CRAF III, FAATyčinky FAA, FPA, CRAF IIIKvětní poupata CRAF IDužnaté listy sukulentů FAA, FPAStarší listy CRAF II, IIIMladé, jemné listy CRAF IV, V, FAA, FPADřevnaté stonky a kořeny CRAF II, IIIMladé stonky a kořeny FAA, FPAListové pupeny dřevin Navašin, CRAF I, II, IIIStonkové a kořenové apexy, pupeny bylin Fixace vzorků 2011 • prašníky a pestíky z poupat lilie Lilium hybr. • délka poupat: 9, 6 a 5 cm • fixace FAA (s 50% EtOH) 88 hod. • oplach 50% EtOH 2 x 30 min • dehydratace butanolovou řadou • prosycení Paraplast Plus® • zalití Paraplast Plus® Dehydratace • během dehydratace dochází často k nejvýraznějším objemovým změnám a deformaci objektů • postupné odvodňovací řady - převáděním objektů sérií roztoků s rostoucí koncentrací organických rozpouštědel dojde k postupnému odstranění vody v objektu • odvodňovací řady: • etanolová • butanolová • acetonová http://kfrserver.natur.cuni.cz/cz/edu/mikro/prep/tprep.htm Dehydratace etanolovou řadou stupeň % etanolu ve vodném roztoku I 30% II 50% III 70% IV 90% V 96% VI 100% VII 100% VIII 100% začátkem řady je stupeň s koncentrací vody odpovídající koncentraci vody v použité fixáži (např. po FAA s 50% etanolu začínáme od kroku II) doba pobytu objektů v jednotlivých krocích závisí na charakteru a velikosti objektů mladé malé objekty 1-2 hodiny kompaktnější a větší objekty až 24hod. nutno použít intermédium = xylen Dehydratace butanolovou řadou stupeň % EtOH % ButOH % vody I 20 10 70 II 25 15 60 III 30 25 45 IV 30 40 30 V 25 55 20 VI 20 70 10 VII 15 85 0 VIII 0 100 0 butanol je, narozdíl od etanolu, rozpouštědlem parafínu po FAA s 50% etanolem začínáme dehydrataci od kroku III Zalévání do médií - historie • zalévacími médii v histologii byly různé materiály, např. mýdlo, celoidin, různé druhy pryskyřice a vosk • za autora techniky zalévání do parafínu je považován Edwin Klebs, vynikající patolog a metodologický průkopník, působící v Praze, Curychu a v Chicagu • 1869 popsal tuto metodu, která spočívala v odvodnění tkáně alkoholem, následném vysušení a pak obalení ve vosku na způsob jakéhosi pláště, tkáň ale ještě nebyla voskem prosycena • postupně se metody stále zlepšovaly Infiltrace a zalití do média • homogenní prosycení celého objemu objektu zalévacím médiem – postupné a pomalé – laboratorní teplota – 40°C – teplota tání parafínu • podmínkou úspěšného zalití je úplné odstranění rozpouštědel Zalévání do parafínu dehydratace převádění do parafínu zalévání do parafínu Braune et al. 1982 parafínový bloček chlazení Krájení parafínových řezů Braune et al. 1982 rozdělení na bločky krájení řezů lepení bločku na špalík lepení řezů Krájení řezů • vývoj krájecích přístrojů (J.E. Purkyněm nazvaných mikrotomy) nastal ve druhé polovině 19. stol. • prvním mikrotomem byla dobře nabroušená břitva v jedné ruce se držel bloček, pro bezpečnost zanořený např. do korkové zátky, a v druhé ruce břitva • ruční mikrotomy se posléze zdokonalily v mikrotomy strojové, které snadno a rychle krájí kvalitní a celistvé řezy • podle konstrukce a účelu použití se mikrotomy dělí na: – sáňkové – rotační Ruční mikrotom Mikrotomy strojové sáňkový mikrotom Reichert rotační mikrotom Leitz Příprava bločku ke krájení dělení bloku parafínu trimování bločku parafínu přitavení bločku parafínu na dřevěný špalík izolovaný bloček parafínu • 1890 – Mayer: glycerol – bílek + fenol (thymol) • chromová želatina („gelatin and chrome alum“) • poly-L-lysin • podložní skla SuperFrost Ultra Plus® - není nutno používat adheziva • sušení na teplé ploténce Lepení řezů Barvení histologické a histochemické Pojmy: barva barvivo barvení Barva barva - vjem světla podle jeho kvality (λ) purpurová 700 nm červená 650 nm oranžová 600 nm žlutá 550 nm zelená 500 nm modrá 450 nm fialová 400 nm průchodem světla přes barevné preparáty dochází k absorpci světla komplementární barvy Teorie barevnosti • chromoforová: chromofor – má charakteristické uspořádání atomů, které je zodpovědné za absorpci světla v určité části spektra, auxochrom – část molekuly, která zodpovídá za vazbu na substrát • kyselé radikály: -OH, -COOH, -SO3H anionická barviva • bazické radikály: -NH2 kationická barviva • chinoidní struktury ∀ π – el. páru Barvivo • ne všechny barevné sloučeniny mohou být barvivem • barvivo = barevná sloučenina, která může být navázána na substrát • barvivo histologické - barví různé složky pletiv • histochemické barvení - barvící proces je vysoce specifický, chemicky definovaný Kriteria dělení barviv • rozpustnost rozpustná ve vodě, v etanolu • způsob aplikace • barva červeň, modř, žluť, zeleň, hněď, čerň • chemická struktura • typy chromoforů • původ (přírodní, syntetická) • přírodní karmín - červec nopálový orcein - lišejníky (Lecanora, Roccella) hematoxylin - dřevo kampešky (Hematoxylon campechianum) brasilin - dřevo druhů rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) indigo - Indigofera tinctoria, Isatis tinctoria juglon - listy, kořeny, kůra (Juglandaceae) • syntetická Dělení barviv podle původu Karmín kyselina karmínová Dactylopius coccus Wikipedia Orcein archil, orchil, lacmus, litmus a C.I. Natural Red 28, potravinářské barvivo E 121 Hematoxylin a hematein hematoxylin - sloučenina tmavě modrofialové barvy ze dřeva Haematoxylon campechianum Používá se s mořidly - nejčastěji Fe3+ nebo Al3+ barví teprve jeho oxidovaná forma = hematein lze barvit regresivní i progresivní metodou – záleží na formě aplikace mořidla Podélný parafínový řez semenem sněženky Galanthus nivalis L. regresivní barvení Heidenheinovým železitým hematoxylinem (Fe 3+ jako mořidlo, optimální diferenciace = v jádech buněk embrya i endospermu jsou patrná tmavěji zbarvená jadérka (modré šipky) endosperm embryo osemení (testa) suspenzor Indigo Indigofera tinctoria Indigofera sumatrana Isatis tinctoria dnes již vyráběné synteticky pro vlastní barvení řezů se nepoužívá, ale v histochemii jsou často používány tzv. indigogenní metody, při kterých je indigo výsledným produktem reakce detekce aktivity β-glukosidasy: substrátem pro enzym je 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukopyranosid kryostatový řez listem tabáku po inkubaci v médiu se substrátem tloušťka řezu 30µm Indigogenní metoda 1. krok = štěpení substrátu enzymem 3. krok = dimerace a oxidace na indigo Indigogenní metoda histochemické lokalizace aktivity β-glukosidasy Zm-p60.1 substrát: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glukopyranosid transgenní tabák se Zm-p60.1 netransgenní kontrola inkubace celé rostlinky, kultivace 28 DAS na MS s t-Z Chmelík et al. 2010 Dělení barviv podle chromoforů • nitrobarviva (trinitrofenol) -NO2 • azobarviva (oranž G, Bismarkova hněď, Sudan IV, Fast Blue B…) -N=N• fenylmetanová barviva = arylmetanová (p-rosanilin, fuchsin, Magenta, genciánová violeť, Fast green) • chinolinová barviva (indofenol, aziny) • xanthenová barviva (fluorescein, eosin, Giemza = azureosinát, rhodamin) • ftalocyaninová (alcianová modř) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace Barvení in toto barvení celých objektů před zalitím a krájením řezů Barvení řezů řezy volné („free floating sections“) řezy přilepené na podložním skle • Barvení progresivní: barvíme do žádané intenzity zbarvení • Barvení regresivní: preparát přebarvujeme a pak postupně odbarvujeme (diferencujeme), podle afinity struktur k barvivu se některé odbarví zcela, jiné zůstanou zbarvené (Heidenheinův železitý hematoxylin, safranin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení ortochromatické: pletivo se barví toutéž barvou jako má barvivo • barvení metachromatické: jedním barvivem se některé struktury barví jiným tónem než ostatní (Stains - all) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení simultánní: směs barviv v jednom roztoku, složky nesmějí spolu reagovat – Alexander 1969 • barvení sukcedánní (sukcesivní): dvě barviva po sobě, doplňují se barevné tóny, každé barvivo barví jiné struktury  alcianová modř - pravá jaderná červeň  safranin - Fast Green  bazický fuchsin – pikroindigo- karmín /Cajal Brožkova metoda/ Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace Podvojné sukcesivní barvení alciánová modř – pravá jaderná červeň Podélný parafínový řez semenem Capsella bursa-pastoris srdčité embryo a jaderný endosperm, v blízkosti suspenzoru již patrný počátek celularizace endospermu tloušťka řezu 6 um • barvení substantivní: barvení samotným barvivem ve vodném nebo etanolovém roztoku • barvení adjektivní: použití mořidel (soli kovů = kamence, tanin) – barvení adjektivní přímé = směs barviva a mořidla (Ehrlichův, Mayerův, Delafieldův hematoxylin) – barvení adjektivní nepřímé = nejprve řezy moříme a pak barvíme (Heideheinův železitý hematoxylin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol fluorescenční barvivo, které se silně váže na DNA může procházet přes intaktní membrány (= je toxické a mutagenní) může být použito pro barvení živých i fixovaných buněk často se používá pro barvení jader, detekci mykoplazmat a virové DNA v buněčných kulturách Montáž řezů • nabarvené řezy je ještě potřeba zakonzervovat na podložním skle - říkáme „zamontovat“ • 1844 - J.E. Purkyně roku a jeho žák Oschatz popsali svoji metodu montování tak, že nabarvený řez prostě potřeli lakem. Užívali tzv. kopálovou pryskyřici, získanou z tropických stromů, ale znali již i kanadský balzám. Jejich preparáty z té doby jsou stále v dobrém stavu. • kanadský balzám se užívá dodnes, ale používají se i syntetické pryskyřice Odkazy na zajímavé stránky http://www.bristol.ac.uk/vetpath/cpl/histmeth.htm protokoly imunohistochemie http://www.ihcworld.com/antibody_staining.htm protokoly barvení pro pletiva zalitá v pryskyřici http://www.ebsciences.com/staining/orcein.htm encyklopedie http://en.wikipedia.org/wiki/Staining