Samčí gametofyt mikrosporogeneze mikrogametogeneze SE micrograph of an early floral developmental stage Photo: C. J. Runions Cornell University Am. J. Bot. Clarkia xantania (Onagraceae) blizna s čnělkou http://www.botany.org /plantimages větší prašníky menší prašníky petaly sepaly s trichomy Samčí rozmnožovací orgán = tyčinka soubor tyčinek = androeceum • tyčinka se zakládá jako meristematický hrbolek na vrcholu květního základu • z baze nitka (filamentum)‫‏‬ • z apexu prašník (anthera)‫‏‬ prašný váček prašný váček konektiv (spojidlo) prašné pouzdro prašné pouzdro prašné pouzdro prašné pouzdro Meristém květu pryskyřníku Ranunculus apiifolius (J. Amerika) R. Rutishauser, Zurych Botanická zahrada Ženeva spirálovitá fylotaxe primordií tyčinek Stavba stěny prašníku • exothecium = pokožková vrstva s kutikulou stomium, hypostomium • endothecium = subepidermální, vláknitá vrstva • střední vrstva = mezofyl, parenchymatické pletivo • tapetum = výstelka prašného pouzdra – žlaznaté (sekretorické)‫‏‬ – ameboidní = periplazmodium prašné pouzdro tetrády tapetum exothecium endothecium mezofyl konektiv s CS nitka prašný váček stomium Řez prašníkem lilie – stadium tetrád Řez prašníkem lilie – metafáze I.meiot. dělení prašné pouzdro PMC tapetum exotheciumendothecium mezofyl konektiv s CS nitka prašný váček stomium Funkce tapeta • produkce enzymu kalázy (β1,3-glukanáza) rozkládá kalózu a uvolňuje mikrospory z tetrád)‫‏‬ • syntéza prekurzorů exiny • syntéza a vylučování pylového tmelu (depozice na povrchu pylových zrn)‫‏‬ • syntéza proteinů (depozice ve vnější vrstvě pylových zrn - exině)‫‏‬ Vývoj buněk tapeta • vnější a vnitřní tapetum – má dvojí původ • předmitotická fáze - buňky jednojaderné meristematické • mitotická fáze – mitóza bez cytokineze + endomitóza = 2 polyploidní jádra, zvětšuje se i objem buněk • postmitotická fáze – vesikulární útvary = vysoká syntetická a sekreční aktivita • programovaná buněčná smrt buněk tapeta nezralá stěna vakuola Meióza I a II kaláza 1. mitóza jádro veget. buňky jádro generat. buňky odvodnění pylová mat. buňka tetráda volné mikrospory mikrospora nezralé pylové zrno zralé pylové zrno klíčící pylové zrno 2. mitóza migrace jádra apertura dozrávání tvorba mikrospor tvorba gamet kalózová stěna spermat. buňky pylová láčka jádro schéma vývoje dvoubuněčného pylu Meióza = redukční dělení I. heterotypické dělení segregace homologních chromozómů • profáze • leptoten • zygoten - bivalenty • pachyten • diploten – chiasmata, CO • diakineze • metafáze • anafáze • telofáze interfáze mezi I. A II. dělením je krátká = nedochází k syntéze DNA II. homeotypické dělení = ekvační – dochází k segregaci alel průběh je shodný s mitózou Mikrosporogeneze vývoj mikrospor ze sporogenních buněk subepidermální buňky meristem. hrbolku primární archespor sporogenní buňky mikrosporocyty pylové mateřské buňky (PMC) tetrády mikrospor mikrospory redukční meiot. dělení kaláza Typy tvorby tetrád sukcesivní typ - ihned po I. meiotickém dělení vzniká centrifugálně přehrádka (diáda mikrospor) a po II. meiotickém dělení tetráda (častý u jednoděložných rostlin) simultánní typ - po I. meiotickém dělení přehrádka nevzniká, teprve po skončení II. meiotického dělení začíná centripetálně (od periferie dovnitř) tvorba brázd a následně přepážek (typický u dvouděložných rostlin) Typy tetrád tetraedrická příčná izobilaterální lineární polinárium Mikrogametogeneze = vývoj samčích gamet mikrospory pylová zrna dvoubuněčná (Liliaceae – lilie, Rosaceae Solanaceae - tabák, ) pylová zrna tříbuněčná (Brassicaceae - Arabidopsis Asteraceae, Poaceae) mitóza v pylovém zrnu 1x 2x 30% z 2000 analyzovaných druhů Sporoderma - stěna pylového zrna • vnitřní vrstva = intina – pektocelulózová (spojení intiny s okolním prostředím = apertury (póry) v exině, kanálky)‫‏‬ • vnější vrstva = exina – sporopolenin – endexina (nexina) = hladká lamelární vrstva – ektexina (sexina) = strukturovaná základní vrstva bakuly tektum • pylový tmel – lipidy, proteiny, flavonoidy, aromatické látky Stavba exiny pylového zrna pelyňku (Artemisia) tektum bakuly základní vrstva sporopolenin ektexina endexina lamelární vrstva TEM pylového zrna pryšce (Euphorbia) (Cresti et al. 1992) dvoubuněčný pyl: u 75% studovaných kvetoucích rostlin dělení generativní buňky na 2 buňky spermatické probíhá v pylové láčce Variabilita pylu Lilium Passiflora Accacia – polyády (8,12,16 nebo 32) Torenia Arabidopsis Edlund et al. 2004 Cucurbita pepo L. AQUASEM mnoho apertur – polysyfonické klíčení pylu Mikrosporogeneze u Lilium IASPR International Society for Sexual Plant Reproduction Research http://images.iasprr.org/lily/ Mikrosporocyty v rané profázi I. většinu profáze I představuje precizní párování homologních chromosomů endothecium mezofyl tapetum exothecium stomium IASPRR Mikrosporocyty v rané profázi I. detail IASPRR Střed profáze I. pachytene - chromosomy jsou velmi prodloužené, spárované homologní chromosomy vyměňují genetický materiál IASPRR Pozdní profáze I. pokračuje kondenzace homologních chromosomů - blíží se diakinese IASPRR detail předchozího snímku Pozdní profáze I. IASPRR Diakinesis diakineze = poslední stadium profáze I před metafází endothecium mezofyl tapetum exothecium IASPRR Diakinesis detail předchozího snímku IASPRR Metafáze I. metafázní chromosomy IASPRR Anafáze I. homologní chromosomy přemístěné na opačné buněčné póly, přesné dělení genetického materiálu IASPRR Telofáze I. výrazná buněčná přepážka se tvoří mezi jádry po I. meiotickém dělení u lilie (diády), druhé meiotické dělení probíhá rychle endothecium mezofyl tapetum IASPRR Telofáze I. detail diád IASPRR Metafáze II. separace chromatid během II. meiotického dělení endothecium mezofyl tapetum exothecium IASPRR Metafáze II. detail tapetum IASPRR Cytokineze tetrád. Separace buněk začíná brzy od stěny microsporocytu. Telofáze II. tapetum IASPRR Tetrády v "callose special wall" Kalóza tvoří obal tetrád uvnitř staré stěny mikrosporocytu. Mikrospory se oddělují od stěny mikrosporocytu, zakulacují se a tvoří primexinu = prekursor templátu pro pozdější ukládání exiny. tapetum IASPRR Kalóza tvoří obal tetrád uvnitř staré stěny mikrosporocytu. Mikrospory se oddělují od stěny mikrosporocytu, zakulacují se a tvoří primexinu = prekursor templátu pro pozdější ukládání exiny. Tetrády v "callose special wall" tapetum IASPRR Tetrády mikrospor dokončování tvorby tetrád – jejich prodlužování IASPRR Tetrády mikrospor tapetum dokončování tvorby tetrád – detail IASPRR Mikrospory uvolněné z tetrád mikrospory mají již exinu (vnější stěna tvořená sporopoleninem), plní se zásobními materiály a zůstávají po krátké období pružné IASPRR Mikrospory uvolněné z tetrád mikrospory mají již vytvořenou mladou exinu = (vnější stěna tvořená sporopoleninem) IASPRR Mikrogametogeneze u Lilium IASPRR International Society for Sexual Plant Reproduction Research http://images.iasprr.org/lily/ Dvoubuněčný pyl Generativní buňky se tvoří zpočátku v kontaktu s intinou (vnitřní vrstva stěny pylu), později se vnoří do cytoplasmy = "a cell within a cell". IASPRR Dvoubuněčný pyl detail generativní buňky v buňce vegetativní IASPRR Tvar generativní buňky často vřetenovitý, buňka je v kontaktu s vegetativním jádrem = "male germ unit." Cytoplazma generativní buňky je hustá = méně vakuol a organel. Dvoubuněčný pyl IASPRR Hydratovaná pylová zrna lilie Foto: G. Obermeyer Mikrosporogeneze a mikrogametogeneze u tabáku dvoubuněčný pyl Schéma vývoje prašníků a pylu tabáku Goldberg et al. 1993 Stadia vývoje prašníku tabáku Koltunov et al.1990 otevírání prašníkůotevření květu12 zralá pyl. zrnakoruna zpola otevřená 11 spojení prašných pouzder 8 mizí tapetumkoruna přes kalich 3 tetrádypetaly na úrovni sepalů -1 meiozaprašníky pod bliznou -2 intenzivní dělení-6 začátek diferenciaceprimordia tyčinek-7 Vývoj prašníku Goldberg et al. 1993 Nicotiana tabacum L. SR1 vakuolizované mikrospory stadium 2 vnější tapetum vnitřní tapetum mezofyl endothecium Vývoj prašníku tabáku -2 2 3 8 meiosis mikrospory pylová zrna mikrosporogeneze Nicotiana tabacum L. -2 -1 1 metafáze I.dělení počátek tvorby tetrád tetrády mikrospora se zbytky kalózy Nicotiana tabacum L. endothecium exothecium kryostatový řez – asi 40 um zbytky mezofylu a tapeta Nicotiana tabacum L. desikovaný pyl 3 (-4) apertury SEM, vysušeno metodou „critical poit dry“, pozlaceno Pylová zrna Nicotiana tabacum L. apertury vegetativní jádro generativní jádro fluorescence DNA, autofluorescence exiny autofluorescence exiny a plastidů DAPI, UV PEG sections Mikrosporogeneze a mikrogametogeneze Arabidopsis tříbuněčný pyl Arabidopsis thaliana Twell et al. TIPS, 1998 tříbuněčný pyl Arabidopsis thaliana Twell et al. TIPS, 1998 tetráda mikrospor hlavní (polární) osa Arabidopsis thaliana Twell et al. TIPS, 1998 mutant sidecar pollen kontrola mutant gemini předčasné dělení a polarizace jedné buňky změna polarizace lat52-gus Přehled stadií vývoje květu A.thaliana Smyth et al. 1990 The Plant Cell, 2, 755-767, 1990 Stadium Charakteristický znak 1 Vznik květního základu 2 Tvorba květního primordia 3 Formace primordií sepalů 4 Sepaly překrývají meristem 5 Vznik primordií petalů a tyčinek 6 Sepaly uzavírají pupen 7 Zakládání nitky u primordií dlouhých tyčinek 8 Diferenciace prašných pouzder 9 Primordia petalů na bázi užší, rychlý růst nahoře 10 Petaly na úrovni krátkých tyčinek 11 Diferenciace bliznových papil 12 Petaly na úrovni dlouhých tyčinek 13 13 – antheze Roeder et Yanofsky 2006 5. Vznik primordií petalů a tyčinek Vývoj květu u A.thaliana (Smyth et al. 1990)‫‏‬ 8. Diferenciace prašných pouzder u dlouhých tyčinek 5 8 Stadia vývoje květu Arabidopsis 9 - petaly nahoře širší 9 10 – velikost květu 2x větší, petaly na úrovni kratších tyčinek 10 11 – diferenciace bliznových papil 11 12 12 – petaly na úrovni delších tyčinek Smyth et al. 1990 Tetrády pyluArabidopsis mutant quartet narušení degradace pektinových složek stěny, tetrády zralých životaschopných pylových zrn Arabidopsis mutant tes/stud abnormální tvar apertur přirozené tetrády pylu Drosera binata Edlund et al. 2004 i Ericaceae nebo Juncaceae Celkový tvar pylového zrna podle poměru poledníkové (m) a příčné osy (a) velmi protáhlá m:a = větší než 8:4 protáhlá m:a = 8:4 až 8:6 slabě protáhlá m:a = 8:6 až 8:7 kulovitá m:a = 8:8 slabě zploštělá m:a = 6:8 až 7:8 zploštělá m:a = 4:8 až 6:8 Velikost pylových zrn vzdálenost pólů (polární rozměr) a ekvatoriální rozměr velmi malá menší než 10 um Myosotis malá 10 – 25 um Salix střední 25 – 50 um Cyanus velká 50 – 100 um Pinus velmi velká 100 – 200 um Abies obrovská nad 200 um Cucurb Variabilita velikosti pylových zrn variabilita i v rámci jedné rostliny, častá polymorfie Stanley et Linskens 1974, Unar 1992 Morfologická charakteristika pylových zrn – podle apertur (Erdtman 1969) NPC systém N – počet (numerus) P – poloha (positio) C – tvar (character) typy apertury – porus (okrouhlé až mírně oválná apertura) -kolpus (oválná až úzce štěrbinovitá apertura) viz skripta Lux et Erdelská (2001) Příklady různých typů pylových zrn 1 – trizonoporátní (bříza) 2 – pentazonoporátní (olše) 3 – trizonokolpátní (javor, tabák) 4 – polypantoporátní (merlík, tykev) 5 – hexapantokolpátní (kuřinka) 1 2 3 4 5 Diferenciální barvení pylu Alexander 1969 • 95% ethanol 10 ml • malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% rozt. v 95% eth.)‫‏‬ • destilovaná voda 50 ml • glycerol 25 ml • fenol 5g • chloralhydrát 5g • kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodný roztok)‫‏‬ • oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodný roztok)‫‏‬ • ledová kys. octová 1 - 4 ml Hodnocení viability pylu • barvení – často nadhodnocuje životaschopnost pylu • fluorescenční mikroskopie – aktivita enzymů: esterázy (substrát FDA), peroxidázy (substrát TTC) • klíčivost pylu in vitro • médium pro klíčení pylu in vitro nebo s přídavkem 1% agaru – nanesení filmu média na podložní sklo