Opylení a oplození u krytosemenných rostlin vývoj poznání o opylování rostlin dehiscence prašníků přenos pylu klíčení pylu a růst pylové láčky syngamie a konfluace Vývoj poznání o rostlinné sexualitě Počátky poznání procesu opylování Rudolf Jakob Camerarius (1665 –1721) německý lékař a botanik, ředitel botanických zahrad v Tübingen (1687) studium reprodukce rostlin - první pokusy popisující pohlavnost rostlin, domníval se, že přenos pylu se děje jen větrem bažanka Mercurialis špenát Spinacia, Ricinus, Zea 1694 - De sexu plantarum epistola Počátky poznání procesu opylování • 20. léta 18. století anglický zahradník Philip Miller objevuje opylování hmyzem (The Gardeners and Florists dictionary, London 1724). • první polovina 18. stol. - Johann Jacob Dillenius (1687 – 1747) objevil kleistogamii = vznik plodů a semen i tam, kde se květy vůbec neotvírají. Joseph Gottlieb Kölreuter 1733 –1806 německý botanik vystudoval na univerzitě v Tübingen pracoval i v St. Peterburku získal semena po umělém opylování Dianthus, Hyoscyamus, Matthiola, Nicotiana Joseph Gottlieb Koelreuter 1733 -1806 • považován za zakladatele nauky o biologii kvetení • 1756 - 1760 při svých hybridizačních, kultivačních pokusech a pozorováních již rozlišoval celkem čtyři typy rozmnožování rostlin: – autogamii v uzavřených květech = kleistogamii – autogamii jako důsledek pohybu tyčinek a pestíků – anemofilii – entomofilii Vorlaufige Nachricht von einigen das Geschlecht der Pflanzen betreffenden Versuchen und Beobachtungen (Leipzig 1761) Giovanni Battista Amici (1786-1863) prof. fyziky v Modeně 1823 - první krok ke správnému vysvětlení oplození = objev pylové láčky, jež proroste skrz čnělku do semeníku u Portulaca oleracea 1840 zavedl používání olejové imerze do mikroskopické techniky (Osservazioni microscopiche sopra varie piante, Memorie della Società Italiana delle Scienze, 19: 234 –255, Modena 1823) Dehiscence prašníků • koordinována s dozráváním pylu • zahrnuje program postupné destrukce buněk • je zakončena prasknutím stomia • kontrola JA fáze dehiscence: 1. degenerace střední vrstvy a tapeta 2. expanze buněk endothecia – fibrosní stěna 3. degenerace septa mezi prašnými pouzdry 4. prasknutí stomia 5. nerovnoměrné sesycháním buněk endothecia Zralé pylové zrno při dehiscenci • metabolicky v klidu • silně desikované ( obsah vody jen 15 – 35%) Přenos pylu Samosprašnost (autogamie) samoopylení = opylení květu přenesením vlastního pylu z prašníku na bliznu – pyl z téhož květu (= idiogamie) - nutnost oboupohlavného květu a časová synchronizace dozrávání vajíček a pylu • přenos pylu při vzájemném dotyku tyčinek a pestíku (větrem, zavírání a otvírání květu - chasmogamický květ) • květy vůbec neotvírají a opylení proběhne přímo v neotevřeném květu (v poupěti), kde se prašník s pylem přímo dotkne blizny = kleistogamie (krytosnubnost) klejistoamický květ (ječmen, Viola, Oxalis, Drosera) – pyl z květu téže rostliny (= geitonogamie) Výhody samoopylení • záruka vytvoření potomstva • není třeba opylovačů - výhodné v oblastech s nedostatkem opylovačů (např. v horách) nebo při rychlém osídlování krátkodobých biotopů • udržuje dobře adaptované genotypy • minimální genetické ztráty • není třeba vynakládat energii na lákání opylovačů hrách, Arabidopsis Nevýhody samoopylení • především evoluční - nedochází ke vzniku nových kombinací v genomu • mohou se kumulovat nevhodné mutace • klesá podíl heterozygotních jedinců v následujících generacích a vzrůstá homozygotnost, vznikají tzv. čisté linie. • roste „inbreeding“ mezi blízce příbuznými liniemi Samosprašnost v ovocnářství • samosprašný je strom nebo kultivar, pokud se opylí pylem z libovolně umístěného květu stejného kultivaru (např. některé broskvoně, meruňky, višně) • cizosprašný je strom nebo kultivar, pokud k opylení potřebuje jiný kultivar (na druhém stromu nebo i na větvi přiroubované na strom, o jehož opylení se jedná (např. (hrušně, jabloně, třešně, rybíz) Strategie zabránění samoopylení • dvoudomost • inkompatibilita pylu a blizny daného jedince • časové oddělení pohlaví: – protogynie, proterogynie = nejprve dozrávají vajíčka v semeníku (jabloň, Clematis) – protandrie, proterandrie = nejprve dozrávají pylová zrna (šalvěje, zvonky) • prostorové oddělení pohlaví: heterostylie (různočnělečnost) = pyl z tyčinek se nemůže přenést na bliznu, i morfologické rozdíly (prvosenka, len, kyprej) – distylie – tristylie • samčí sterilita Heterostylie u prvosenky (distylie) http://botany.upol.cz/atlasy/anatomie/anatomieCR46.pdf Krátkočnělečné květy vytvářejí větší pylová zrna, která se lépe uchytí mezi většími bliznovými papilami dlouhočnělečných květů. Pyl z květů s krátkými nitkami tyčinek lépe klíčí na bliznách s krátkou čnělkou. V prašnících dlouhočnělečných květů s krátkými nitkami tyčinek vzniká pyl jemnější, jehož zrnka odpovídají velikostí drobnějším papilám na bliznách krátkočnělečných květů. Pylová zrna z květů s dlouhými nitkami tyčinek lépe klíčí a pylové láčky rychleji rostou na bliznách dlouhočnělečných květů. Cizosprašnost (allogamie) • přenesení pylu z tyčinek na bliznu jiného květu • nevýhody: – potřeba druhého jedince – vyšší náročnost spojená s přenosem pylu investice do přizpůsobení a množství pylu – nutnost odměn a lákadel pro opylovače • evoluční výhoda: vznik nových kombinací v genomu – možnost reagovat na měnící se podmínky Zprostředkování přenosu pylu • vítr (větrosnubnost - anemogamie) • voda (hydrogamie) • opylovači – hmyz (hmyzosnubnost - entomogamie) – jiný živočich • ptáci (ornitogamie) • letouni (chiropterogamie) • vačnatci, savci • měkkýši (malakogamie) ? Wikipedia Anemogamie • uskutečnění přenosu pylu pomocí větru • přizpůsobení květů: – redukce květních částí – není třeba lákat opylovače, ale velké investice do množství pylu (oleje + bílkoviny) → výroba se energeticky „prodraží“ – tyčinky - dlouhé nitky, pohyblivé prašníky (např. vrtivé prašníky trav) – pyl = drobný, lehký, sypký, někdy s létacím zařízením – měchýřky – blizna - dlouhá, chlupatá • listnáče kvetou před vývojem listů, které by bránily přenosu pylu • výskyt: trávy, ostřice, jehličnany, ořešák, dub, bříza, topol, jasan, líska Hydrogamie • přenos pylu pomocí vody - jak ve vodním sloupci, v proudu i na hladině • přizpůsobení květů: – redukované květní části – dlouhé blizny k zachytávání pylu – pyl - dlouhý nebo slepující se → lepší splývání ve vodě a zachycení na blizně • výskyt: hvězdoše (r. Callitriche), růžkatce ( r. Ceratophyllum), vodní mor (r. Elodea), některé rdesty (r. Potamogeton) Hmyzosnubnost - entomogamie • nejstarší způsob zoogamního opylování a zároveň nejčastější způsob opylování krytosemenných rostlin • prvními opylovači byli brouci (viz cykas), pak blanokřídlí, dvoukřídlí, motýli,... • přizpůsobení: – hmyz má dobrý čich → květy voní nebo páchnou – hmyz je citlivější na modré části spektra a UV → přizpůsobení barev květů (noční motýli – bílé květy) – „naváděcí čáry do středu květu a k nektariím“ – produkce pylu a nektaru Strategie lákání opylovačů • zvyšování teploty – cykasy - brouci – Crocus – Dracunculus drakovec obecný Dracunculus vulgaris - může zvýšit teplotu v květu až o 22°C Ornithogamie • přenašeči pylu = ptáci • přizpůsobení: – ptáci mají špatný čich → květy nevoní – ptáci mají dobrý zrak, spektrum vnímaných barev se blíží našemu → červené květy – robustní a velké květy uzpůsobené na větší hmotnost opylovače (ale existují výjimky, např. květy opylované kolibříky mohou být na tenkých stopkách a otočené dolů → kolibřík opyluje za letu pod květem) • příklady: – J. Afrika - dřeviny rodu Protea – strdimilové (Nectarinidae) – australská rostlina Anygozanthos „klokaní tlapa“ – medosavky – Hawaii - šatovníci Protea cynaroides původem z Jižní Afriky jižní oblasti provincie Kapsko Dnes je pěstována jako řezaná květina v tropech a subtropech celého světa, zejména v Austrálii, na Novém Zélandě a na Havaji. stříbřenec pcháčohlavý (Presl 1846), stříbrnec (Presl 1848), protea (Mareček 1999) Chiropterogamie • přenašeči pylu = letouni • přizpůsobení: – rostliny se otvírají v noci či za šera – mají světlou barvu – vydávají pachy plesnivění, kažení, hnití… • příklady: – baobab a kaloni – divoké banánovníky a kaloni → každou noc se odklopí nejvyšší listen a zpřístupní řadu květů a každou noc přilétá hejno kaloňů hodovat na nektaru - pyl na sebe nanášejí nebo opylují s již dříve nabytým pylem. Následující ráno listen i s květy uvadne a odpadne a zůstanou jen semeníky s oplozenými vajíčky. Nejdříve se odklápí listeny s květy samičími a až jsou všechny oplozeny, pak se otvírají květy samčí (proterogynie) Klíčení pylu a růst pylové láčky Adheze pylu na blizny – první kontakt • přenos pylu – biotické nebo nebiotické přenašeče • adheze pylu podmíněná: – morfologií exiny – pylovým tmelem (lipidy a proteiny, glykoproteiny) – typem blizny (exudát nebo pelikula) Typy blizen (Hanf 1935) • vlhké blizny – v době zralosti pokryté tekutým exudátem – glycidy, lipidy (Solanaceae, Liliaceae, Poaceae) • suché blizny – kryté proteiny, kutikulou nebo voskem (Brassicaceae, Caryophyllaceae) Inkompatibilita (neslučitelnost)‫‏‬ = neschopnost rostlin tvořit semena, přestože mají funkční gamety před 200 lety – J.G. Kölreuter Verbascum: po samoopylení netvořila semena po cizosprášení ano • Stout (1917) - studium fertility Cichorium intybus Suché blizny a 3 buněčný pyl • již na povrchu blizny se projevuje inkompatibilita sporofytického typu (proteiny z tapeta)‫‏‬ • je daná genotypem rostliny, která produkuje pyl (sporofytem), bez ohledu na genotyp si pyl ponechává fenotypovou reakci dominantní alely Suché blizny – s papilami blizna Torenia fournieri barvena Auraminem O blizna Arabidopsis barvena FM1-43 200 μm 200 μm Vlhké blizny a dvoubuněčný pyl • inkompatibilita gametofytického typu se projevuje až při prorůstání pylových láček přes pletiva čnělky a zárodečného vaku - zastavování růstu pyl. láček = je určována genotypem samotného pylového zrna (gametofytu) • u čeledí Viciaceae, Solanaceae Místa interakcí samčího gametogytu s pestíkem povrch pylového zrna: pylový tmel proteiny ve sporodermě bliznový exudát ttekutinaekutina kankanáálulu ččnněělkylky placentární tekutina exudát mikropyle Willemsee (Haworthia – vlhká blizna) Stadia klíčení pylu 1. adheze na blizně 2. rehydratace pylového zrna 3. klíčení pylového zrna 4. růst pylové láčky Edlund et al. 2004 Aktivace pylového zrna rehydratace ve vlhku (na blizně, in vitro) Klíčící pylová zrna netýkavky Impatiens glandulifera (Cresti et al. 1992) Klíčení pylového zrna • hydratace pylu • aktinový cytoskelet se přesunuje k místu klíčení • přesunuje se vegetativní jádro typy klíčení: monosyfonické – nejčastější (u růží – větvení) polysyfonické (Daphne mezereum – lýkovec jedovatý, Althaea - proskurník topolovka, Scabiosa - hlaváč Anilinová modř, UV Fluorescence pylových láček pylu klíčícího na blizně Plné a duté čnělky Arabidopsis Lilium Lord 2001 Zóny pylové láčky • čepička • pod čepičkou = zóna vysokého obsahu proteinů • zóna komplexního endomembránového systému • vakuolizovaná část (kalózové zátky) Model pro růst pylové láčky lilie Lord 2000 arabinogalaktanové proteiny stigma-style cysteine-rich adhesin Růst pylových láček Camacho et Malhó 2003 rychlost až 50um /min je umožněna vysoce polarizovanou fůzí váčků, které transportují složky buněčné stěny k vrcholu hlavní roli v regulaci hraje gradient [Ca 2+] barvení barvivem FM1-43 ukazuje lokalizaci endocytických váčků na vrcholu pylové láčky Model pro růst pylové láčky Agapanthus Camacho et Malhó ( 2003) Endo–exocytosis in the pollen tube apex is diferentially regulated by Ca2+ and GTPases. J. Exper.Bot. fosfolipáza C fosfatidilinositol difosfát Podélný kryostatový řez čnělkou tabáku plná čnělka s převodovým pletivem převodové pletivo = podélně protáhlé buňky s mezibuněčným prostorem vyplněným pektiny i proteiny Ontogeneze pylové láčky • aktivace pylového zrna - hydratace • klíčení pylového zrna • invaze pylové láčky do blizny – AcP, esterasy (kutinasy), proteasy, RNAsy • růst pylové láčky • stárnutí pylové láčky Přesun MGU v průběhu klíčení pylu u Arabidopsis Lalanne et Twell, PP 2002 Struktura vrcholu pylové láčky Mascarenhas 1993 Fáze vedení pylové láčky u Arabidopsis thaliana. Higashiyama et al. 2003, Curr. Opinion in Plant Biologysuchá blizna Navigace pylové láčky WT magamata FG mutant Weterings a Russel 2004 Regulace růstu pylových láček Torenia Torenia Arabidopsis Higashiyama et Hamamura 2007 A. thaliana - růst pylových láček in vitro Palanivelu a Preuss 2006 neoplozená vajíčka A. thaliana emitují difusibilní, vývojově regulované, druhově-specifické atraktanty vajíčka penetrovaná pylovou láčkou uvolňují rychle difusibilní repelenty pro další pylové láčky = zabránění polyspermie Lat52:GFP Stárnutí pylové láčky pozorováno jen u láček pěstovaných in vitro • zastavení růstu • utvoření kalózové čepičky na vrcholu láčky • vakuolizace vrcholové části • degenerace celého obsahu Typy růstu pylové láčky do zárodečného vaku • z čnělky prorůstají pylové láčky do pletiva semeníku a placentou k vajíčkům • do vajíčka vnikají pylové láčky – mikropylí (porogamie) – chalázou (chalázogamie) – nebo integumenty (mezogamie) – • pylová láčka se dostává do mikropylární části zárodečného vaku – do synergidy Synergidy pylová láčka vstupuje do zárodečného vaku přes receptivní synergidu známky receptivity synergidy: • reorganizace cytoskeletu • Ca2+ akumulace • degenerace organel a plazmatické membrány Dvojí oplození u krytosemenných rostlin Dvojí oplození u krytosemenných rostlin vlastní oplození je u krytosemenných rostlin dvojí objeveno r. 1898 ruským botanikem S. G. Navašinem (a 1899 nezávisle na něm Francouzem L. Guignardem) Sergej Gavrilovič Navašin (1857 - 1930) • studoval v Petrohradu • a na univerzitě v Moskvě • prof. botaniky v Kyjevě • 1898 popisuje dvojité oplození u krytosemenných rostlin – Novyje nabljuděnija nad oplodotvorenijem u Fritillaria tenella i Lilium martagon (součást sborníku Dněvnik X. sjezda russkich estěstvoispytatělej i vračej v Kijevě) – krátké sdělení v německém časopise Botanisches Zentralblatt Neue Beobachtungen über Befruchtung bei Fritillaria tenella und Lilium martagon 1898: Sergej G. Navašin: popis dvojího oplození u Fritillaria a Lilium na zasedání botanické sekce Přírodovědné společnosti v Kyjevě v Rusku (24.8. 1898) - krátké sdělení publikováno v německém časopisu Botanisches Zentralblatt: Botanické výstavy a kongresy Jean-Louis Guignard • 1852 - 1928 1882 – popsal vývoj zárodečného vaku z hypodermálních buněk nucelu 1883 – potvrdil Flemingem pozorované podélné dělení chromozomů 1889 – potvrdil Strassburgerem popsanou meiozu 1899 – objevil dvojí oplození u rostlin http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-2830901769.html Průběh oplození • vstup pylové láčky do synergidy • DNasa degeneruje vegetativní jádro a jádro synergidy • spermatická buňka je přenesena do vaječné buňky a druhá do centrální buňky (apozice plazmatických membrán) • svazky aktinových mikrofilament tvoří dvě koronovité struktury – zprostředkují kontakt jader • karyogamie – splývání jader: – syngamie – konfluace • plazmagamie – splývání cytoplazmy Karyogamie a plasmagamie Karyogamie = splývání jader • syngamie - splývání jader vaječné a spermatické buňky • konfluace - splývání jader centrální a spermatické buňky Plasmagamie = splývání cytoplasmy buněk Geny užívané pro „live imaging“ dvojitého oplození HTR10/AtGMH3 LAT52 vegetativní buňka a pylové láčky MYB98 synergidy Sandaklie-Nikolova et al., 2007 Eady et al., 1994 Rotman et al., 2003; HISTONE2B-RFP Ingouff et al.,2009jádro vaječné buňky Fluorescenční markery pro samčí a samičí gamety Arabidopsis dvoubuněčný pyl pLAT52-GFP ve vegetativní buňce (v) a pHTR10-HTR10-RFP v generativní buňce (g) tříbuněčný pyl pLAT52-GFP ve vegetativní buňce (v) a pHTR10-HTR10-RFP ve spermatických buňkách (s) Berger, J. Exper Bot. 2011 zárodečný vak: exprese pEC1-HISTONE2B-RFP v jádře vaj. buňky (ec) a pFWA-GFP v centrální buňce (cc) měřítko = 10 um