Téma 04: Životaschopnost (vitalita) pylu a metody její detekce Životaschopnost pylu je jedním z hlavních faktorů, které rozhodují o úspěšnosti oplození. Byla popsána řada metod, které testují životaschopnost pylu přímo = klíčení pylu in vitro na umělých médiích nebo nepřímo = barvením pylových zrn. Důležitými faktory klíčivosti pylu je kromě složení média teplota, pH, relativní vlhkost vzduchu, zralost pylu i hustota suspenze. Histologické barvení pylových zrn může vitalitu pylu nadhodnocovat, přesnější bývají histochemické metody detekující aktivitu hydrolytických enzymů (esterázy – substrát fluorescein diacetát FDA) nebo oxidačně-redukčních enzymů (dehydrogenázy – substrát trifenyltetrazolium chlorid TTC, který váže vodík uvolněný dehydrogenázami za tvorby červeného reakčního produktu formazanu). Materiál: pylová zrna lilie (Lilium hybr.), bramboříku (Cyclamen persicum MILL.), fuchsie (Fuchsia magellanica Lam.) apod. Brewbaker – Kwackovo médium pro klíčení pylových zrn (Brewbaker et Kwack 1964): 100 ml 10% sacharosy H[3]BO[3] 10mg Ca(NO[3])[2] . 4 H[2]O 30mg MgSO[4] . 7 H[2]O 20mg KNO[3] 10mg Alexandrova barvící směs pro diferenciální barvení pylu (Alexander 1969) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu)‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml fenol 5 g chloralhydrát 5 g kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodného roztoku)‏ oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodného roztoku)‏ ledová kys. octová 1 - 4 ml Fluorescein diacetát 2 mg ve 100ml acetonu A. Testování klíčivosti pylu in vitro Postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku Brewbaker – Kwackova média, do které naprášíme pylová zrna. 2. Inkubaci provádíme ve vlhké komůrce metodou stojící nebo visící kapky. 3. Po 30 min. intervalech kontrolujeme četnost klíčících pylových zrn a délku pylových láček. Hodnocení: Vyhodnotíme rychlost klíčení pylu a četnost klíčících pylových zrn u předložených vzorků. B. Diferenciální barvení pylu Postup I.: 1. Na podložní sklo nakápneme několik kapek Alexanderovy barvící směsi. 2. Do kapky barviva naprášíme pylová zrna a přikryjeme krycím sklem. 3. Po několika minutách vyhodnotíme zbarvení pylových zrn. Poznámka: Vzhledem k tomu, že chloralhydrát a fenol jsou na seznamu nebezpečných chemických látek a vyžadují speciální bezpečnostní zacházení i likvidaci odpadu, testovali Peterson et. al. (2010) použití barvící směsi s vynecháním těchto látek a zjistili, že výsledky jsou víceméně srovnatelné s původní metodou Alexandera. Ke zlepšení penetrace barviva autoři navrhují použití Carnoyovy fixáže a zahřátí preparátu při barvení. Upravená barvící směs bez toxických látek (Peterson et al. 2010) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml kyselý fuchsin 5 ml 1% vodného roztoku)‏ oranž G 0,5 ml 1% vodného roztoku ledová kys. octová 4 ml + destilovaná voda 4,5 ml = celkový objem směsi 100 ml Postup II.: (Peterson et al. 2010): 1. Fixace poupat nebo izolovaných prašníků v Carnoyově fixační směsi alespoň 2 hod. Ve fixáži je možno skladovat materiál až 12 měsíců. 2. Umístění prašníku na podložní sklo a odsátí fixáže. 3. Přidání 2 – 4 kapek barvící směsi. 4. Zahřátí skla protažením nad plamenem kahanu téměř k varu – zlepšuje se penetrace barviva dovnitř pylových zrn. 5. Přikrytí krycím sklem a jeho jemné přitlačení zajistí srovnání pylových zrn do jedné roviny. Výsledek: Dobře vyvinutá pylová zrna jsou zbarvena červeně, abortovaná pylová zrna jsou zelená. Hodnocení: Zjistíme poměr vyvinutých a abortovaných pylových zrn. C. Hodnocení vitality pylu nebo buněčné suspenze detekcí aktivity esteráz Postup: 1. Na podložní sklo kápneme kapku roztoku fluorescein diacetátu v acetonu a necháme uschnout. 2. Přikápneme kapku pylové suspenze v médiu Brewbaker et Kwack (1964). 3. Přikryjeme krycím sklem a po 15 minutách pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu v modrém světle. Výsledek: Životaschopná pylová zrna s aktivními esterázami vykazují žluto-zelenou fluorescenci. Hodnocení: Srovnáním obrazu v procházejícím světle a ve fluorescenci vyhodnotíme poměr životaschopných pylových zrn. Literatura: Alexander M. P. (1969): Differential staining of aborted and nonaborted pollen. - Stain Technol., 44: 117-22. Brewbaker J. L. and Kwack B. H. (1964): The Calcium Ion and Substances Influencing Pollen Growth. In: "Pollen Physiology and Fertilization", Linskens, H. F. (Ed.). North Holland, Amsterdam, pp. 143–151. Peterson R., Slovin J.P., Chen Ch. (2010): A simplified method for differential staining of aborted and non-aborted pollen grains. - International J. Plant Biol. 2010; 1:e13 doi:10.4081/pb.2010.e13