Dr. Martin Trbušek Fakultní nemocnice Brno Výzkumné strategie pro využití čipových technologií Základní typy „microarrays“ •Expresní čipy (mRNA, microRNA) GEP •Genomické čipy (CGH, SNP) •Resekvenační čipy An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is 011209f3a.jpg Object name is 011209f3a.jpg Na co vždy pamatovat: •Microarrays jsou technicky velmi náročné •Časově velmi náročné a pěkně drahé •Vyžadují doprovodné metodiky pro ověření výsledků – např. u expresních čipů real-time PCR, Western blot atd. (čipem nic nekončí!) •Musí stavět na silném intelektuálním zázemí výzkumné skupiny (velký problém – málokdy splněno!) Přinést zásadní nový poznatek pomocí „čipů“ není jen tak A dále…. •Měly by stavět na originálním uspořádání experimentu také málokdy splněno, zkoumá se vyzkoumané; náš největší kamarád je PubMed! (www.pubmed.com) •Vyžadují vědeckou upřímnost nepřikrášlovat si výsledky, „ani když už jsem do toho tolik investoval…“, např. vynechání nepohodlných vzorků. Fujtajksl. • Moderní technologie velmi rychle stárnou….. •Microarrays – vrchol zhruba 2000-2005 Mezitím vývoj různých platforem….Agilent vs. Affymetrix; aCGH vs. SNP čipy •A pak přišlo sekvenování nové generace (NGS) A můžeme začínat znovu…… • Čipy se nejčastěji používají v onkologii Základní společné rysy nádorových buňky Deregulace buněčného cyklu (narušení kontrolního bodu G1/S) Únik před apoptózou (programovanou buněčnou smrtí) Udržování „životaschopné“ délky telomér Zajištění „kvalitní“ opravy DNA (zejména v G2 / M-fázi buněčného cyklu) Invazivita v primární tkáni Angiogeneze Metastázování Selekce nových rezistentních klonů léčbou Nádorová buňka a buněčný cyklus G1 → S → G2 → M G1/S S G2/M Univerzální inaktivace v nádorových buňkách Mutace p53, Rb, Atm, p16 a jiné Kontrolní body DNA damage hypoxia telomere shortening etc. Cell cycle checkpoints p21WAF 14-3-3s Gadd 45 Reprimo Apoptosis PUMA NOXA Bax Scotin KILLER/DR5 p53AIP1 Fas/Apo1/ CD95 FasL IGF-BP3 PIGs PIDD Senescence p21WAF Inhibition of pathological angiogenesis Tsp1 BAI1 Maspin GD-AIF p14ARF ? p53 MDM2 ATM ATR DNA PK oncogene activation DNA repair Gadd45 p48 p53R2 P53 ubiquitination and degradation ? posttranslational modification of p53 activation and stabilisation Modelová situace I p53 a expresní čipy Podrobněji k dráze p53: poškozeni (…) - signalizováno dalšími proteiny - modifikace p53, aktivace a stabilizace. Aktivovaný p53¨- aktivace transkripce genů zahrnutých v… i represe a protein-protein interakce Přísná regulace hladiny p53 v normální buňce - přes MDM2. p53 - tr. faktor, funguje jako tetramer, 393 aminokyselin, 50 kDa Nádory reagují dobře na „low-dose RT“ (ovšem jen ty s wt-p53) Blood 2007; 110: 1116-22. Analýza expresních čipů profituje zejména z dokonalé znalosti funkce studovaných genů (to umožňuje přejít od genů k procesům) A pak to stojí za to obr Stankovic et al., Microarray analysis reveals that TP53- and ATM-mutant B-CLLs share a defect in activating proapoptotic responses after DNA damage but are distinguished by major differences in activating prosurvival responses. Blood 2004 IR indukuje > 1 000 genů Přibližně 1/3 v dráze p53 Procesy jsou fajn, ale …. kam nás zavedou? •Výsledkem GEP může opravdu být objevení zajímavých genů, ale co dál? • •Máme na to a chceme vůbec zkoumat jevy vzdálené od našeho hlavního tématu? Výrazná změna genomu se dá očekávat pouze při zásadních jevech CLL Lymfoblastický relaps Prominentní amplifikace onkogenu MYC-N v buňkách z relapsu Array CGH Potvrzená pomocí real-time PCR….. Nmyc last popisky Resekvenace na čipech Affyscannerimage1128x128 genomic DNA ® long-range PCR ® quantification (PicoGreen) ® pooling ® purification ® fragmentation (20-200 bp) ® labelling ® hybridization (16 h) ® staining and washing ® scan ® data analysis Resekvenace - výstup Obrázek3 Sample 1 (reverse) Mejzlikova 9 Sample 2 (forward) Loukotova 9 heterozygous mutation, both alleles of ATM gene are preserved homozygous mutation, one allele of ATM gene is deleted (98% of cells) Doprovodná data: jsou esenciální exon 9 - 735 C>Y (245 Val>Val) association with skipping of exon 9 (Gronbeg et al., 2002) …pro správnou interpretaci… RT- PCR ® PCR with cDNA primers ® electrophoresis: samples 1-3 with mutation, samples 4-7 without mutation excision of bands ® direct sequencing: the skipping of exon 9 is confirmed!! skipping ex 9 - CLL patients A po čipech: žádná nuda v Brně 110 CLL pacientů; sekvenace genu ATM; 62 exonů, 3056 aa, 9168 nt Cesta k úspěchu s microarrays - 1. část 1) K těmto metodikám přistoupit až po několika letech práce v laboratoři (min. 2-3 roky); to se týká zejména GEP 2) Být si jistý, že opravdu chci dělat microarrays 3) Důkladně projít PubMed pro studované téma a anticipovat nejbližší možné výsledky!!! 4) Nenápadně zjistit, zda je náš vedoucí „v obraze“ – jeho pomoc budeme potřebovat! 5) Mít k dispozici doprovodné metodiky, které určitě budeme potřebovat (real-time PCR, Western blot) 6) Mít k dispozici funkční tým, kde každý něco opravdu UMÍ Cesta k úspěchu s microarrays – 2. část 7) Mít velmi dobře charakterizované vzorky (mutace není delece apod.) 8) Před započetím experimentování se spojit s velmi dobrým statistikem (konzultovat mj. velikost souboru) 9) Neukvapovat se po prvních pozitivních výsledcích 10) Pokud se dostaneme až k psaní manuskriptu, dát jej přečíst co nejvíce (relevantním) lidem 11) Připomínky reviewers brát vážně Takže děkuji za pozornost • • • ….a uvidíme se (asi) v prosinci