„„Next-Gen“ SequencingNext-Gen“ Sequencing
Boris Tichý
16.12.2011
LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERLÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSSITYITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN BrnoInterní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapieCentrum molekulární biologie a genové terapie
Nové technologie (od r. 2005)
Massive parallel sequencing
Statisíce až miliardy paralelních sekvenací
Klonální amplifikace/sekvenování
Jednotlivé sekvence odpovídají jednotlivým molekulám DNA/RNA
Single molecule sequencing
Techniky pro přímé sekvenování jednotlivých molekul DNA/RNA
2010 → řada dostupných technologií
454, Illumina, SOLiD, PacBio, Helicos, IonTorrent, Complete Genomics
Klonální amplifikace
Emulzní PCR (emPCR)
454, SOLiD, Polonator
PCR reakce uzavřeny v mikroreaktorech
Kulička, enzym, nukleotidy
Voda v oleji
Klonální amplifikace
Bridge amplifikace
Illumina
Templát i PCR produkty fixovány k povrchu flow-cell
Vznik “clusters”
Sekvenování
Sekvenování syntézou
Illumina, Helicos, Pacific Biosciences, IonTorrent, 454
Reverzibilně terminační, fluorescenčně značené nukleotidy
Illumina, Helicos
Fluorescenčně značené nukleotidy
PacBio (SMRTTM
)
Neznačené nukleotidy
IonTorrent (změny pH), 454 (pyrosekvenace)
Sekvenování
Sekvenování ligací/hybridizací
SOLiD, Polonator, Complete Genomics
Hybridizace a ligace fluorescenčně značených sond
Ligáza připojí sondu k primeru
Sonda – degenerovaná, známý je pouze nukleotid na sekvenované pozici
Single nebo two base kódování
Většinou jen krátké úseky
Sekvenování
Dlouhé vs. krátké
SOLiD – max. 75b
Illumina - max. 150b (250b paired-end)
Roche (454) – max. 600b
PacBio – až 10.000b
Další generace?
Single molecule
Nanopores
Electron microscopy
Využití
Stejné nebo širší jako microarrays
Celogenomové sekvenování (resekvenování i de-novo)
Lze objednat, od ~ $10.000 (výzkum od $4.000)
Deep sequencing (sekvenování s vysokým pokrytím)
Sekvenování mikrobiomu, metagenomika
Epigenomika
Genová exprese
BGI – největší sekvenační centrum (Čína)
> 130 přístrojů poslední generace
Kapacita > 1 900 000 000 000 000 bazí ročně (~ 300.000 lidských genomů)