Molekulární biotechnologie •Regulovatelné promotory • Promotor a operátor •Promotor je regulační oblast, na kterou se váže RNA polymeráza a jiné proteiny podmiňující zahájení transkripce s ním sdružené transkripční jednotky •Operátor je regulační oblast na DNA, na kterou se specificky váže protein označovaný jako represor. V důsledku vazby represoru na operátor se zastaví transkripce operonu tj. •přepisování genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA katalyzovanou RNA polymerázou. Regulovatelné promotory •Umožňují kontrolovat transkripci operonu tak, •že k expresi klonovaného genu dochází •pouze v určitém stadiu růstového cyklu buněk a •pouze po určitou dobu •Dají se vypínat a zapínat (přídavkem určité látky, změnou teploty) Zapnutí promotoru •Uvolnění pro vazbu RNA polymerázy a •Pro transkripci Vypnutí promotoru •Zabránění vazby RNA polymerázy •Zabránění transkripce img004 Laktózový operon E.coli (Glick a spol.2003) •Regulace exprese lac operonu – Obr. • Nejvíce používané regulovatelné promotory •lac a trp promotory z laktózového a tryptofánového operonu E. coli •tac promotor (in vitro konstrukt, který obsahuje -10 oblast lac promotoru a -35 oblast trp promotoru) •levý pL promotor fága lambda (E.coli) •promotor genu 10 bakteriofága T7 (E.coli) •Jedná se o silné promotory • Silný promotor •Často se na něj váže RNA polymeráza a •Dochází k syntéze mRNA Přehled regulovatelných promotorů, jejich původ, způsob vypnutí a zapnutí •Tab •. Používají se •Různé kombinace klonování promotorů a represorů •S cílem zabezpečit regulovanou expresi klonovaného genu Regulace genové exprese promotorem pL, který vypíná a zapíná teplotně sensitivní represor cI fága lambda (Glick 2003) •. Regulace genové exprese promotorem genu 10 bakteriofága T7 (E.coli) (Glick 2003) •. Průmyslový systém ve velkém •Využívá buněk, které nesou 2 plasmidy, každý s jiným regulovatelným promotorem •Jeden plasmid nese tryptofánový promotor, který kontroluje expresi cI represoru •Druhý plasmid nese pL promotor, který kontroluje expresi klonovaného genu •Represe pL promotoru se docílí růstem buněk na mediu bez tryptofanu (melasa, kaseinový hydrolyzát) •Dereprese se docílí přidáním tryptonu (trypton obsahuje dostatek tryptofanu) Systémy ve velkém využívající 2 různých regulovatelných promotorů, tryptofánového, který kontroluje produkci cI represoru, a pL promotoru, který kontroluje expresi klonovaného genu (Glick 2003) •PřF 19.10.2010 •FCh 21.10.2010