Sekvenační analýza - Sangerova metoda Úvod: o využívá vlastnosti speciálních nukleotidů - 2',3'-dideoxyribonukleotidtrifosfátů (ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP), které nemají na 3' uhlíku ribosy OH skupinu, ukončit syntézu DNA. Pokud tedy DNA polymeráza začlení takový nukleotid do narůstajícího řetězce další nukleotid se nemůže navázat a syntéza DNA řetězce je ukončena. o reakční směs: jednovláknová DNA, DNA polymeráza, pufr, příslušné sekvenační primery, 2´-deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) a fluorescenčně značené 2´,3´-dideoxyribonukleotidtrifosfáty o použitelná k sekvenování krátké sekvence (až 700bp) jednovláknové DNA Princip: Figure 6.18. Cycle sequencing involves linear amplification using a single primer to initiate DNA synthesis. Úloha: Stanovení přítomnosti mutace v genu pro LDL receptor Úvod: LDLR gen: 19. chromozóm (p13.1 - p13.3), 45kb,18 exonů. Mutace nebo přestavby v genu pro LDL receptor jsou příčinou familiární hypercholesterolémie. Jedná se o autozomálně dominantní onemocnění charakterizované zvýšením hladiny LDL cholesterolu v krvi, která má za následek předčasný rozvoj atherosklerózy. Úkol: Stanovení přítomnosti mutací v genu pro LDL receptor v předložených vzorcích. Pracovní postup: PCR reakce 1. Provedení amplifikace jednotlivých exonů v genu pro LDL receptor podle tabulky: 5 ml ředěné DNA + 20 ml MM a/ (ml) 1x 3x 4x 5x H[2]O 13,25 RB 2,5 Mg^2+ 1,0 dNTP 0,5 Sek9A 1,25 Sek9B 1,25 Taq pol. 0,25 řed.DNA 5ml 5 5 5 a/ amplifikace exonu 9: - sek9A+sek9B primery - 1mM Mg^2+ - program L61 (Ta=61°C) - délka produktu 380bp b/+c/ (ml) 1x 3x 4x 5x H[2]O 12,75 RB 2,5 Mg^2+ 1,5 dNTP 0,5 Sek9A 1,25 Sek9B 1,25 Taq pol. 0,25 řed.DNA 5ml 5 5 5 b/ amplifikace exonu 5: - sek5A+sek5B primery - 1,5mM Mg^2+ - program L57 (Ta=57°C) - délka produktu 268bp c/ amplifikace exonu 12: - sek12A+sek12B primery - 1,5mM Mg^2+ - program L58 (Ta=58°C) - délka produktu 357bp Kontrola PCR produktu - elektroforéza, 2% gel SERVA, nanášet 5ml Předčištění PCR produktu (s využitím QIAquick PCR purification Kit) 1. Do eppendorfky na 2 ml napipetovat 20 ul PCR produktu a 100 ul roztoku PBI. (vždy zachovat poměr 1:5) 2. Celý objem (120 ml) přepipetovat do kolonky a dát stočit na centrifugu 1min/13000otáček. 3. Odstředěný objem vylít, do kolonky přidat 700 ml roztoku PE a dát stočit na 1min/13000ot. 4. Odstředěný objem opět vylít a dát stočit na 3min/13000otáček. 5. Kolonku umístit do nové eppendorfky (2ml) a do středu kolonky opatrně nanést 20-35 ml H[2]O (dle síly PCR produktu). 6. Vzorek nechat stát ve vodorovné poloze asi 15 minut. 7. Vzorek dát stočit na 2min/13000ot., poté kolonku vyhodit a u eppendorfky s předčištěním PCR produktem změřit koncentraci. V této fázi lze opět provést kontrolu PCR produktu pomocí elektroforézy za stejných podmínek. Sekvenační DEYSSEQ reakce (s využitím BigDye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing kit) (ml) 1x 0,5x H[2]O 5,5 6,0 PCR produkt 1,0 0,5 Primer 0,5 0,5 5xSB 1,0 1,0 TRRM 2,0 2,0 Vysušení produktu 1. Zvortexovat kolonku pro resuspendaci reninu. 2. Uvolnit závit spodní části kolonky o ¼ otočení, ulomit jej a umístit kolonku do speciální sběrné nádobky. 3. Takto nachystaný vzorek dát na centrifugu 3min/3000otáček (0,8rcf). 4. Přenést kolonku do čisté eppendorky na 2ml. 5. Opatrně nanést produkt ze sekvenační reakce doprostřed horní části šikmé gelové vrstvy tak, abych se nedotkla gelu ani stěn eppendorky. 6. Produkt dát centrifugovat 3min/3000ot. 7. Vyhodit kolonku, produkt zůstane odstředěný v eppendorfce, do které přidáme formamid v poměru 1:1 ( v našem případě 10 ml FA). 8. Vzorky uschováme do lednice na sekvenaci – automatický sekvenátor ABI 3130xl. Hodnocení výsledků: Subjektivní odečtení výsledků sekvenační analýzy srovnáním s kontrolní sekvencí. Hodnocení pomocí softwaru Mutation Surveyor (Softgenetics LLC).