SMAMII-7 Sekvencování DNA Cíle sekvencování •Stanovení primární struktury DNA tj. •Pořadí nukleotidů v molekulách DNA Znalost sekvence DNA •Lze použít k odvození aminokyselinové sekvence kódovaných proteinů •K odvození regulace jejich tvorby •Umožňuje detailně stanovit charakter mutací (které se projevují např. vznikem genetických chorob) •Urychlila rozvoj dalších metod (např.PCR) Jsou k dispozici principiálně odlišné postupy •Chemická metoda založená na specifické degradaci řetězců NK pomocí chemických sloučenin (Maxam-Gilbertovo sekvencování) •Enzymatická metody založená na inhibici syntézy nového řetězce (Sangerovo sekvencování) 1. Krokem obou metod •Je příprava molekul DNA s přesně definovanými konci •Nejčastěji se používají restrikční fragmenty DNA klonované ve vhodném vektoru nebo •PCR produkty U obou metod musí být splněny tyto požadavky •Definování jednoho z konců fragmentů DNA, jehož sekvence se stanovuje •Vytvoření souboru ss molekul DNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jedinou basi •Rozdělení tohoto souboru fragmentů elektroforézou s takovou rozlišovací schopností, která umožňuje oddělit řetězce lišící se svou délkou o jedinou basi Vyhodnocení získaných sekvencí •S využitím počítačů a speciálních programů - vyhledání •ORF (otevřené čtecí rámce), které mohou být potenciálními geny •exonů a intronů a převedení sekvence nukleotidů do sekvence AK v proteinech •Známých motivů na DNA, charakteristických pro regulační oblasti •Repetitivních sekvencí •Rozpoznávacích míst pro restriktázy (získá se komplexní restrikční mapa) Srovnání •stanovené sekvence nukleotidů nebo z ní odvozené sekvence AK •se sekvencemi uloženými v databankách •v nichž se shromažďují údaje z celého světa Chemická metoda sekvencování •Podstatou je specifické rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalisovaná báze určitého typu Výchozím materiálem •Je soubor identických fragmentů ss DNA •Označených na jednom konci radioaktivní značkou Každá ze 4 basí •je modifikována tak, aby byl v tomto místě přerušen řetězec •Používá se DMS (dimetylsulfát), NaOH, HCOOH (kys. mravenčí) a hydrazin •Podmínky reakce se zvolí tak, aby byla poškozena v průměru pouze 1 base v řetězci •Poté je DNA za vysoké teploty vystavena působení piperidinu, což vede k rozštěpení řetězce v zeslabených místech Reakce je prováděna •Ve velkém souboru molekul •Proto je výsledkem štěpení soubor fragmentů DNA všech různých délek, •Které odpovídají vzdálenoti bazí příslušného typu od značeného konce výchozí molekuly DNA Postup sekvencování probíhá v následujících krocích •Příprava zančených ss fragmentů DNA •Rozdělení souboru fragmentů DNA do 4 vzorků •Působení chemickou látkou, která specificky modifikuje jeden nebo dva typy bazí •Působení chemickou látkou, která vede k rozštěpení řetězců DNA ve všech místech, v nichž byly báze modifikovány •Rozdělení fragmentů DNA elektroforézou v denaturujícím polyakrylamidovém gelu, vzorky z každé ze 4 reakcí jsou na gel naneseny vedle sebe v definovaném pořadí •Autoradiografická detekce fragmentů, detekovány budou pouze ty fragmenty, které nesou označený konec •Stanovení sekvence DNA z autoradiogramu odečtem poloh pásů v jednotlivých drahách . . Chemická metoda sekvencování Nevýhody a výhody Maxam-Gilbertova sekvencování •Data bývají nejednoznačná (reaktivita chemických činidel je ovlivněna nečistotami) •Používá se radioaktivní značení •Poskytuje kratší sekvence •Postup je laboratorně náročnější •Umožňuje stanovit vazbu proteinu na DNA (footprint) 2. Enzymatická metofda sekvencování (Sangerova sekvencování) •DNA, jejíž sekvence má být stanovena, je použita jako matrice •Pro syntézu komplementárních řetězců různé délky •Pomocí DNA polymerázy Vlastnosti DNA polymerázy využité pro sekvencování • Schopnost vytvářet přesné kopie molekuly DNA •Schopnost specifické syntézy DNA řetězce ve směru 5´- 3´od primeru s volnou 3´OH skupinou • Syntéza řetězce na matricové DNA •Je zahájena od místa, ke kterému je připojen sekvenčně specifický primer pro sekvencování •A ukončena v místě kde se do rostoucího řetězce inkorporuje místo normálního dNTP dideoxyribonukleosidtrifosfát) •Postrádá 3´OH skupinu a •Funguje jako koncový inhibitor (terminátor) syntézy DNA • Ukončení řetězce Vhodně zvolený poměr •ddNTP a dNTP (obvykle 1:100) v reakční směsi •Rozhoduje o tom, jak dlouhé řetězce, náhodně zakončené v místech začlenění ddNTP •Budou DNA polymerázou syntetizovány • Provedení reakce •Ve 4 zkumavkách, každá pro stanovení pozice jedné baze •Reakční směs obsahuje: •Purifikovanou molekulu DNA, jejíž sekvence má být stanovena •Primer, připojující se k části molekuly DNA nebo k místu připojení na vektoru, v případě, že jde o klonovanou DNA •Směs 4 normálních dNTP a jeden ze 4ddNTP •DNA polymerázu Jako DNA polymeráza se používá •Klenowův fragment DNA polymerázyI •T 7 DNA polymeráza zbavená 3´ exonukleázové aktivity (Sequenáza) •Zpětná transkriptáza •Taq DNA polymeráza Jako primery lze použít •Krátké restrikční fragmenty •Synteticky připravené oligonukleotidy (18 bazí) •Stejné primery, se kterými byl fragment DNA amplifikován • • Řada vektorů je pro účely sekvencování •Cíleně upravena •Po obou stranách MCS obsahuje krátké specifické sekvence, k nimž se připojují •Universální sekvenační primery •Např. Vektoty odvozené od bakteriofága M13 – M13mp18, M13mp19, které umožňují •Sekvencovat oba řetězce naklonované DNA Pro umožnění detekce nově syntetizovaných řetězců •Je primer, ddNTP nebo jeden ze 4 dNTP radioaktivně nebo neradioaktivně označen •Po proběhnutí reakce se vytvořené produkty denaturují a •Separují na polyakrylamidovém denaturujícím gelu •Odečtení sekvence z autoradiogramu nebo hybridisační membrány (u neradiaktivně značeného primeru) •Při manuálním provádění je možné stanovit sekvenci dlouhou 300 až 400 bází Enzymatická metoda sekvencování Automatické sekvencování DNA •Pokrok v enzymatické metodě •Plně automatizované přístroje pro separaci reakčních produktů, detekci, shromáždění dat a analýzu pořadí bazí •Mnohem rychlejší •Délka stanovené sekvence je mezi 500-1000bp • Odlišnosti automatického sekvencování • Probíhá metodou asymetrické PCR (s nadbytkem 1 primeru nebo jen s 1 primerem) •S využitím Taq DNA-polymerázy •K detekci reakčních produktů se 4 různé fluorescenční značky, každá určená pro detekci produktů zakončených specifickou bazí • Automatické sekvencování Chemie fluoroforů •Využívá 2 odlišné přístupy: •Barevně značené primery •Barevně značené terminátory •Fluorofory: FAM (6-karboxyfluorescein) •TET (6-karboxy-2´,4,7,7´-tetrachlorofluorescein) •HEX (2´,4,4´,5´,7,7´-hexachlorofluorescein) •TAMRA (5-karboxytetrametylrhodamin) •Primer definuje 5´konec molekul produktů a začleněný ddNTP definuje totožnost báze na 3´konci • Polymerisační reakci •Lze provést v 1 zkumavce obsahující •Templátová DNA, primer, 4 dNTP, 4 značené ddNTP •Výhodou použití barevně značených terminátorů je skutečnost, že jsou vizualizovány pouze produkty zakončené barevně značeným ddNTP (a nikoliv produkty předčasně ukončené syntézy – snížení signálu pozadí) •Detekce produktů probíhá v průběhu elektroforézy automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač •U novějších aparatur probíhá elektroforetická separace v kapilárách • Další metody sekvencování •Hydrogensiřičitanové sekvencování (pro odlišení C a 5-metylC u obratlovců a vyšších rostlin) •Pyrosekvencování (nevyžaduje značené primery nebo dNTP ani elektroforézu). Je založené na uvolnění pyrofosfátu (PPi) při enzymatické syntéze DNA. Následuje kaskáda enzymatických reakcí a v konečném kroku je emitováno viditelné světlo. •Sekvencování pomocí hybridisace (SBH). Varianta je prováděna s využitím technologie DNA čipů. •Minisekvencování (pro ověření ss polymorfismů, je založena na prodloužení 3´konce primeru o jediný značený nukleotid) Pyrosekvencování •Sekvenační primer je hybridisován s ss DNA a je inkubován s DNA polymerázou I z E.coli, ATP sulfurylázou, luciferázou, apyrázou, adenosin 5´-fosfosulfátem (APS), luciferinem Potom se postupně přidávají •(jeden po druhém) všechny 4 dNTP (označované dXTP) Pokud se na matricové molekule vyskytuje komplementární base k přidanému dXTP, DNA polymeráza katalyzuje připojení nukleotidu k primeru •Pokud na matrici není komplementární sekvence, nukleotid je degradován apyrázou •Každé připojení je provázeno uvolněním pyrofosfátu (PPi DNA) v ekvimolárním množství k zabudovanému primeru Uvolněné PPi •jsou kvantitativně převáděny ATP sulforylázou za přítomnosti APS a ATP, což umožňuje luciferázou zprostředkovanou konverzi luciferinu na oxyluciferin •Oxyluciferin vytvoří světelný záblesk, který lze zaznamenat detektorem fotonů a zobrazit jako vrchol na pyrogramu •Namísto standardního dATP je popužíván 2´-deoxyadenosin-5´-tio-trifosfát, který je zpracován DNA polymerázou ale nikoliv luciferázou Pyrosekvencování DNA Rychlost pyrosekvencování •1 base za minutu, běžná délka 100 bazí •Pyrosekvencování v roztoku a na pevné fázi (s využitím imobilizované DNA) Sekvencování pomocí hybridizace s použitím DNA čipu Minisekvencování na DNA čipu