O podstatě buněčných  stěn kvasinek
Prof. MUDr.  Marie Kopecká, CSc. 
Biologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity
Kamenice 5, A6, 625 00 Brno
mkopecka@med.muni.cz
http://www.med.muni.cz/~mkopecka/
tel. 54949 4778
Buněčná stěna kvasinek
• 1. Chemická podstata?
• 2. Ultrastruktura?
• 3. Funkce?
• 4. Mechanismus vzniku?
• 5. Na jakých modelech zkoumat?
• 6. Jakými metodikami ?
Modely použité ke studiu podstaty a
ultrastruktury buněčné stěny kvasinek
• Celé buňky
• Protoplasty
• Isolované buněčné stěny kvasinek
• Purifikované biopolymery buněčné stěny
kvasinek in vitro
Saccharomyces cerevisiae :
Nečas, 1956, 1961, 1965, 1971…; Gabriel 1965,1968,1973, 1984,1992, 1994; Gabriel et al. 1992, 1998, 2000,
2003,2006.. ; Svoboda 1965,1966, 1974,1992, 2005; Eddy a Williamson 1957, 1959; Nečas a Svoboda 1981, 1985.
1. celé buňky
2. nahé protoplasty
3. isolované stěny buněk
4. in vitro assembly
Metodické přístupy ke studiu 
buněčných stěn kvasinek
• Světelná mikroskopie 
(fázový kontrast, diferenciální interferenční kontrast)
• Fluorescenční mikroskopie
• Elektronová mikroskopie transmisní (TEM)
• Elektronová mikroskopie skenovací SEM)
• Rentgenová difrakční analysa (zahraniční spolupráce)
• Purifikované enzymy (zahraniční spolupráce)
• Specifické inhibitory 
• Mutanty (získané ze zahraniční)
• Radioisotopy 
• In vitro assembly
Ultrastruktura buněčné stěny kvasinkové buňky
studovaná transmisní elektronovou mikroskopií
• 1. za použití technik freeze-fracturing
• a freeze-substituce
se jeví buněčná stěnajako bezstrukturní.
• 2. použití techniky ultratenkých řezů
• ukázalo jen 2 vrstvy stěny:
• – vnější vrstva je elektropositivní,
• - vnitřní vrstva je elektronegativní.
Závěr: Ultrastruktura buněčné stěny kvasinky zůstává
nejasná.
Dalším modelovým objektem studia
buněčných stěn kvasinek se staly
protoplasty
• „Nahé“ protoplasty (stěna buněk enzymaticky odstraněna)
rostou v tekutých médiích.
• Na svém povrchu vytvářejí „fibrilární sítě“.
• Jaká je jejich podstata?
• Jaká je jejich ultrastruktura?
• Jakým mechanismem vznikají?
Výchozí literatura o stěně kvasinky Saccharomyces cerevisiae v šedesátých letech
Chemické složení stěny
Phaff HJ (1963) Cell wall
of yeasts.
Ann Rev Microbiol 17: 15‐30.
• β‐1,3‐glukany
• β‐1,6‐glukan
• mannan
• chitin 
• proteiny 
• lipidy ?
Struktura stěny kvasinky:
Houwink AL, Kreger DR (1953)
Observations on the cell wall of
yeasts. An electromicroscope and
X‐ray Diffraction study. Antonie van 
Leeuwenhoek 19: 1‐24.
Nativní stěna kvasinek
• v ELM amorfní (nefibrilární)
• rtg difrakce: jen difusní difrakční
diagramy→ chybí krystalický polymer
Stěny po varu 0.5 N HCl 3 hod:
• objevily se mikrofibrily z
krystalického glukanu
(=hydroglukan)
• krystalický hydroglukan
• krystalický chitin
krystalizace hydroglukanu a 
chitinu in vitro z uvolněných 
lineárních řetězců
• 1st ISYP Jena (1965): Kopecká, Čtvrtníček, Nečas: „O podstatě „fibrilárních
sítí“, které se tvoří jako první stádium biogenese stěny u protoplastů
kvasinky Saccharomyces cerevisiae“ .
• PODSTATA FIBRILÁRNÍCH SÍTÍ PROTOPLASTů ?
Vlastnosti sítí:
• Proteasy •
Lipasy •
Hlemýždí
enzymy +
• PAS reakce (mannan) •
30% HCl -
(chitin)
• 3% NaOH
(glukan) +
Závěr:
„fibrilární sítě“protoplastů jsou z alkali-solubilního
glukanu
• PODSTATA FIBRILÁRNÍCH SÍTÍ PROTOPLASTů dále
studována POMOCÍ RENTGENOVÉ DIFRAKČNÍ
ANALYSY ve srovnání s HCl-stěnami (tzv. „HCl-stěny“=
„HYDROGLUKAN“ byl ukázán na přednášce - (po 3 hod
varu stěn kvasinky Saccharomyces cerevisiae v 0,5 N HCl se
stává rozpustný v alkáliích).
• Sítě protoplastů po odstranění
chitinu dávají vznik diagramu shodnému s
lineárním β-1,3-glukanem paramylonem
• Závěr: sítě obsahují lineární β-1,3-glukan.
Publikace o podstatě fibrilárních sítí protoplastů
• Kopecká, M., Čtvrtníček, O., Nečas, O. 1967.
Formation and properties of the fibrillar network formed in yeast protoplasts as the first step of
biosynthesis of the cell wall. In: “SYMPOSIUM ON YEAST PROTOPLASTS“. Jena 21.-
24.9.1965. R. Müller (ed.). Akademie Verlag Berlin (1967), pp.73-75, 343-344.
• Kreger, D. R., Kopecká, M. 1973. On the nature of the fibrillar nets formed by protoplats of
Saccharomyces cerevisiae in liquid media. In: “Yeast, Mould and Plant Protoplasts”. J. R.
Villanueva, I. Garcia-Acha, S. Gascon, F. Uruburu (eds.). Academic Press London and New York
(1973), pp. 117-130.
• Kreger, D. R., Kopecká, M. 1976.
• Assembly of wall polymers during the regeneration of yeast protoplasts. In: “Microbial and Plant
Protoplasts”. J. F. Peberdy, A. H. Rose, H. J. Rogers, E. C. Cocking (eds.). Academic Press
London, New York, San Francisco (1976), pp. 237-252.
• Kreger, D. R., Kopecká, M. 1976. On the nature and formation of the fibrillar nets produced by
protoplasts of Saccharomyces cerevisiae in liquid media: an electronmicroscopic, X-ray diffration
and chemical study. J. Gen. Microbiol. 92:207-220.
• Kreger, D.R., Kopecká, M. 1978. Nature of the nets produced by protoplasts of
Schizosaccharomyces pombe during the first stage of wall regeneration in liquid media. J. Gen.
Microbiol. 108: 269-274.
• Kreger, D.R., Kopecká, M. 1981. The molecular organization of chitin in normal and regenerated
walls of Saccharomyces cerevisiae. A reconsideration of ultrastructural data. In: “Cell walls
1981”. Proceedings of the Second Cell Wall Meeting. Göttingen. D.G. Robinson, H. Quader
(eds.). Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart (1981), pp. 130-134.
Metodický přístup:
(i) Učinek purifikované chitinasy na sítě protoplastů
(ii) Účinek purifikované endo-β-1,3 glukanasy ze Schizosacch.japonicus na sítě
protoplastů
Výsledky:
Purifikovaná chitinasa nedegraduje mikrofibrily
fibrilárních sítí
zatím co purifikovaná β-1,3-glukanasa degraduje
mikrofibrily.
Závěr: mikrofibrily protoplastů S. cerevisiae jsou z
β-1,3-glukanu.
Z čeho jsou vystavěny mikrofibrily –
z glukanu nebo chitinu?
MECHANISMUS VZNIKU MIKROFIBRIL?
2 možné mechanismy vzniku mikrofibril β-1,3-glukanu: autoorganisací
?
- „enzyme-directed“ assembly?
Vlhké vzorky(m) Suché vzorky(d)
A. In vitro dialysa
C.In vitro neutral. 4°C
B. In vitro neutralisace 69°C
D.Nativní sítě protopl.
Výsledky studia mechanismu vzniku mikrofibril jsou v publikaci:
Kopecká, M., Kreger, D.R. 1986. Assembly of microfibrils in vivo and in vitro from 1,3-β-D-glucan
synthesized by protoplasts of Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 143:387-395.
Šířky triple-helixů z rtg analysy
in vivo a in vitro vzorků mikrofibril
ověřovány v ELM při zvětš. 300 000x
In vivo: triple-helix 15.3 nm, v ELM 1.6 nm
In vitro: triple helix 17.2 nm, v ELM 1.7 nm
In vivo vytvořené mikrofibrily jsou z triple-helixů šířky 15. 3 nm,
v ELM se jeví jako elementární fibrily šířky 1. 6 nm.
In vitro vytvořené mikrofibrily jsou z triple-helixů šířky 17. 2 nm,
V ELM se jeví jako elementární fibrily šířky 1. 7 nm.
[Kopecká a Kreger (1986) Arch Microbiol 143:387-395]
Nativní mikrofibrily vznikají mechanismem „enzyme-directed
assembly“
• In vivo vytvořené mikrofibrily jsou z triplehelixů
šířky 15. 3 nm, které se v ELM se jeví
jako elementární fibrily šířky 1. 6 nm.
Průkaz elementárních fibril elektronovou
mikroskopií je v publikaci:
• Kopecká, M., Gabriel, M. 1992. The influence of
Congo red on the cell wall and 1,3-ß-D-glucan
microfibril biogenesis in Saccharomyces
cerevisiae.
http://www.springerlink.com/content/n2n66763n
7213404/
Jsou mikrofibrily také v buněčné stně kvasinek?
Purifikované enzymy užité k selektivní degradaci biopolymerů stěny
kvasinek Saccharomyces cerevisiae (poskytnuté H. J. Phaffem)
Účinkem pronasy došlo k částečnému odstranění vnější amorfní stěnové
komponenty -mannoproteinové vrstvy- pod ní je jemná fibrilární textura,
zatmelená amorfními glukany (viz dále)
Purifikovaná bakteriální endoendo--ββ--1,61,6--glukanasglukanasaa aa endoendo--ββ--1,31,3
glukanasglukanasaa z Bacillus circulans odstraňují ze stěn kvasinky
Sacch.cerevisiae amorfní komponentu, ale mikrofibrilární skelet stěny
(„exoskelet“) není degradován a dál uchovává původní tvar buňky
Purifikovaná endo-β-1,3-glukanasa ze Schizosaccharomyces
japonicus degradovala mikrofibrily stěny i amorfní glukan,
resistentní byly jen jizvy po pučení a agregáty amorfního
mannoproteinu.
[Kopecká, Phaff a Fleet (1974) J. Cell Biol. 62, 66-76].
MikrofibrilyMikrofibrily jsou i ve stěně celých buněkjsou i ve stěně celých buněk
kvasinkových mutantkvasinkových mutant
1. [Kopecká, Gabriel et al. (1991) J.Gen. Mcrobiol. 137: 1263-1270;
2. Gabriel a Kopecká (1995), Microbiology 141,891-899 ]
i po účinku Konžské červeni
[Kopecká a Gabriel (1992) Arch Microbiol. 158:115-126]
Ultrastruktura buněčných stěn kvasinky Schizosaccharomyces pombe
byla také studována po účinku purifikovaných enzymů elektronovou mikroskopií:
• Purifikovaná endo-β-1,3-glukanasa z Bacillus circulans odstranila
amorfní komponentu z buněčné stěny Schizosaccharomyces pombe a
obnažila mikrofibrily uvnitř stěny, které byly resistentní k účinku enzymu.
Podobný účinek měla i endo-β-1,6-glukanasa.
• Purifikovaná endo-β-1,3-glukanasa kvasinky
Schizosaccharomyces japonicus odstranila longitudinálně orientované
mikrofibrily ze stěn, ale ve stěnách zůstává fibrosní textura s příčnou
orientací. Amorfní materiál přetrvával v oblasti jizev.
• Stěny byly ztráveny až kombinovaným účinkem endo-β-1,3glukanasy
ze Schiz. japonicus + α-1,3-glukanasy z Bacillus
circulans. Nalezeny pouze zbytky neztrávených stěn (jizvy)
[Kopecká, Fleet a Phaff (1995) J. Ultrastruct Res 114:140-152 ]
• Buněčné stěny kvasinky
• Schizosaccharomyces pombe
• obsahují mikrofibrily
• z beta-1,3-glukanu
• a z alfa-1,3-glukanu
• Jakým mechanismem vzniká
• buněčná stěna kvasinek?
• Zkoumání mechanismu autoorganisace
stěnových polymerů in vitro
β-1,3-glukanové mikrofibrily vznikají mechanismem
self-assembly in vitro z purifikovaného β-1,3-glukanu sítí protoplastů
In vitro assembly purifikovaných stěnových
polymerů:
Purifikovaný mannan a purifikovaný β-1,6-glukan mají amorfní charakter.
Purifikovaný β-1,3-glukan sítí protoplastů + mannan + β-1,6-glukan stěn mohou vytvářet nadmolekulární
komplexy in vitro.
Purifik.β-1,3 glukan sítí protopl.+ mannan + β-1,6-glukan stěn+ β-1,3 glukan stěn kvasinek mohou
vytvářet nadmolekulární komplexy in vitro.
Purifik. β-1,3 glukan sítí protopl. + mannan + β-1,6-glukan stěn + β-1,3 glukan stěn kvasinek A2
+ glykogen mohou vytvářet nadmolekulární komplexy in vitro.
Závěr: Při vzniku buněčné stěny kvasinek se
může uplatňovat autoorganisace stěnových
polymerů do nadmolekulárních struktur
Závěry ad protoplasty Saccharomyces cerevisiae
1• Sítě syntetizované protoplasty Saccharomyces cerevisiae v tekutých
médiích jsou z nerozpustných polysacharidů
β-1,3-glukanu a chitinu (90% glukanu a 10% chitinu);
mikrofibrily sítě jsou z β-1,3-glukanu.
2• Protoplasty Saccharomyces cerevisiae syntetizují v tekutých médiích
lineární řetězce β-1,3-glukanu.
β-1,3 glukan „větvící“ enzym, který „přiháčkovává“ ve stěně kvasinek k
lineárním řetězcům boční větve, zřejmě u rostoucích protoplastů v
tekutém mediu chybí (byl tekutým médiem z protoplastů odstraněn).
3• Sítě protoplastů nejsou zatmeleny, protože polymery amorfní matrix
jsou rozpustné ve vodě.
4• Rozdíly v šířce triple-helixů zjištěné rtg difrakcí a ELM svědčí pro to, že
nativní mikrofibrily in vivo nevznikají self-assembly, ale „ enzymedirected
assembly“.
5• Základní stavební jednotkou nativních mikrofibril sítí protoplastů je
elementární fibrila šířky 1.6 nm; její podstatou je triple-helix šířky 1.53 nm
(d) a 1.58 nm (m).
Závěry ad stěna Saccharomyces cerevisiae:
1•V nativní buněčné stěně kvasinky Saccharomyces cerevisiae
jsou mikrofibrily β-1,3-glukanu, které tvoří „exoskeleton“ stěny.
2• Tyto mikrofibrily jsou ve stěně zatmeleny amorfními glukany s β-
1,3- a β-1,6 vazbami, na které se váží vnější mannoproteiny
stěny.
3• Při vzniku stěny kvasinek se může uplatňovat autoorganisace
biopolymerů stěny.
Závěry ad protoplasty a stěna Schizosaccharomyces
pombe
1• Mikrofibrily sítí protoplastů Schizosaccharom. pombe obsahují
β-1,3-glukan a α-1,3-glukan. V sítích po reagregaci in vitro jsou 2
typy mikrofibril.
2• Stěna kvasinky Schizosaccharomyces pombe obsahuje
mikrofibrilární kostru (exoskelet), která je z β-1,3-glukanových a
z α-1,3-glukanových mikrofibril.Fibrilární skelet je maskován
amorfními glukany s β-1,3- a β-1,6-vazbami.
Lipke a Ovale (2002) J. Bacteriol 180: 3735-3740. (Saccharomyces cerevisiae)
Souhrn přednášky
I. STRUKTURA BUNĚČNÉ STĚNY KVASINEK
• 1. Buněčná stěna kvasinek je lokalizovaná na povrchu buněk.
• 2. Je vystavěna z biopolymerů: z polysacharidů a z glykoproteinů.
• 3. Biopolymery zahrnují β‐1,3‐glukany, β‐1,6‐glukan, 
mannoproteiny a chitin.
• 4. Chitin je akumulován v jizvách po pučení, ale část molekul 
chitinu je také dispergována v laterální stěně, kde asociuje s 
dalšími biopolymery. 
• 5. β‐1,3‐glukan asociuje do mikrofibril. Mikrofibrily tvoří rigidní 
skelet buněčné stěny. Ostatní biopolymery tvoří amorfní matrix, 
která zatmeluje mikrofibrilární glukanovou komponentu.
II. PROTOPLASTY KVASINEK JAKO MODELY KE STUDIU 
BIOGENESE NOVÉ BUNĚČNÉ STĚNY
1. Protoplasty Saccharomyces cerevisiae vytvářejí v tekutém živném 
médiu tzv. „fibrilární sítě“. Jsou vystavěny z mikrofibril β‐1,3‐glukanu
(90%) a obsahují také chitin (10%).
2. „Fibrilární sítě protoplastů „obsahují lineární β‐1,3‐glukan, rozpustný 
v NaOH, jehož rentgenový difrakční diagram odpovídá lineárnímu 
polysacharidu paramylonu (zásobní polymer Euglenophyt).
3. „Fibrilární sítě protoplastů „obsahují také rozvětvený β‐1,3‐glukan,
jehož rentgenový difrakční diagram odpovídá rozvětvenému 
glukanu buněčných stěn kvasinek, který je v komplexu s chitinem, a 
tento komplex je nerozpustný v alkáliích.
4. Protoplasty kvasinek, které vytvoří v tekutém médiu jen „fibrilární 
sítě“, nejsou schopné se dělit, a přežívají asi 24 hod.
5. Protoplasty kvasinek jsou však schopné sporulovat. Spory jsou 
životaschopné a schopné přežívat a dát vznik vegetativním buňkám.
III. FUNKCE BUNĚČNÉ STĚNY KVASINEK
• 1. Buněčná stěna kvasinek je lokalizovaná na povrchu buněk, 
a proto poskytuje kvasinkové buňce mechanickou ochranu.
• 2. Buněčná stěna kvasinek je nezbytná pro vývoj geneticky 
podmíněného tvaru buňky (cylindrického, ovoidního atp.).
• 3. Buňky, které jsou zbaveny buněčné stěny, zaujímají tvar 
koule („protoplasty“).
• 4. Buňky zbavené buněčné stěny („protoplasty“) nejsou 
schopné se dělit – nemohou realisovat cytokinesi, ale jaderné 
dělení (mitosa) probíhat může; tak může vzniknout 
vícejaderný kvasinkový útvar, který však není schopen bez 
buněčné stěny přežívat ani se dělit, a časem umírá.
• 5. Buněčná stěna je nutná ke konjugaci kvasinek.
• 6. Buněčná stěna obsahuje enzymy a antigeny. 
IV. BIOGENESE BUNĚČNÉ STĚNY KVASINEK
• 1. β‐1,3‐glukan po rozpuštění může asociovat do 
nadmolekulárních komplexů in vitro na principu 
autoorganisace.
• 2. β‐1,3‐glukan asociuje in vitro autoorganisací do  
mikrofibril.
• 3. Biopolymery stěny mohou asociovat do nadmolekulárních
komplexů na principu autoorganisace molekul in vitro bez 
účasti enzymů, bez dodání energie, bez přítomnosti 
templátových struktur. 
• 4. Tyto nadmolekulární komplexy stěnových biopolymerů
vzniklé in vitro na principu autoorganisace molekul obsahují 
mikrofibrily i amorfní matrix a připomínají texturu buněčné 
stěny. 
Děkuji za pozornost.
Seznam publikací, týkajících se výzkumu buněčné 
stěny kvasinek v období 1965 – 2011
lze nalézt na adrese:
http://www.med.muni.cz/~mkopecka/