Práce s kvasinkami v laboratoři
W303 – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15
•rychle se množící EUKARYOTNÍ buňky (90 min/dělení, 25-30°C)
•vytváří kolonie na „jednoduchých“ agarových plotnách (např. YPD)
•na plotně narostou za 2-3 dny a v tekutém YPD médiu přes noc
•YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa) + 2-3% agar
•SD – minimální (syntetické) médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids - aminokyseliny se
přidávají dle selekce, 20g/l dextrose (2% glukosa)
•lze používat klasické mikrobiologické metody (roztíraní, kapkování, otiskování ploten)
•do ploten je možné přidávat testovací látky (např. HU, MMS …)
•mutagenezí lze připravovat teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C) a chladově sensitivní mutanty
(cs, 20°C) – např. zastavení buněčného cyklu při 37°C
•do buněk lze transformovat DNA (pomocí octanu litného a tepelného šoku nebo elektroporace)
•lineární DNA se integruje do genomu díky vysoké frekvenci homologní rekombinace (takto lze
připravovat deleční a mutantní kmeny)
•plasmidová DNA se replikuje (centromerické a multicopy plasmidy – DNA knihovny)
•

Shuttle vektory
•vychází z 2mm plasmidů nebo centromer (S.c.; 2mm přítomné také v Zygosaccharomyces bailii, Z.
rouxii a Kluyveromyces drosophilarum)
•Kvasinková část – marker (URA3 … kanMX), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2mm (60 kopii na haploidní buňku)
začátek replikace
•Bakteriální část – Kan resistence, Origin
•Promotor, tag, MCS
–Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce)
–Nadprodukce (suprese mutací nebo toxicita)
MET1
Methionin repressed
MFA1  -  MATa haploid specifický

Integrativní plasmidy
- integrativní plasmid pro P.pastoris (GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru v P.pastoris

Integrace I.
- integrativní plasmid pro P.pastoris (GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru

Integrace II.



Integrace III.
u Pichia pastoris dochází u 1-10% transformantů k vícenásobné integraci – vyšší exprese
Pomocí jiného markeru lze integrovat další kazetu

•Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p dekarboxylázou na
toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3- buňky jsou resistentní)
•Buňky se stávají ura-, takže URA3 marker lze využít několikrát
•
Disrupce/delece genu
- Studium funkce genu – fenotyp (1. delece, 2. mutace)
- nezbytný/esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu (plasmid shuffling)
- životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu
- mutantní kmeny lze křížit a hledat funkční příbuznost s jinými geny (synthetic lethal x
epistatic)
1. krok
2. krok

Plasmid shuffling
Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na
plasmidu
Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění
plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA)
Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou červené díky
ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha
blokována dříve než vzniká červený ´metabolit)

Delece genu pomocí transposonů
Defekt buněčné stěny
MacDonald et al.: Nature, 1999
esenciální
Citlivé …

Cre rekombinasa
Postup lze použít několikrát
NAR 24 (1996) 2519–2524

Delece genu - PCR
•pro rekombinaci stačí pouze krátká homologie (50nt)
•oligonukleotidy ~ 70nt dlouhé postačí (při 2 krokové PCR se kromě dlouhé homologie vnesou ještě
specifické sekvence pro pozdější manipulace …)
kanMX
kanMX
kanMX
1.PCR
2.PCR
Kvasinkový ORF
- systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- kmeny lze získat z archivu EUROSCARF

Testy fenotypu-funkce
Buněčná stěna
Oprava DNA
Mikrotubuly
ts
cs
- Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- Funkční kategorie genů – anotace v databázích


~ 6000 heterozygotních delečních kmenů
~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů)
(neesenciální – růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy)
- Testováno ~400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...)
- Celkem provedeno ~ 6milionů testů
- multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potřebný pro resistenci vůči >20% z testovaných látek
- Podobné profily svědčí o funkční podobnosti
Science 320 (2008), p.362

Životní cyklus S. cerevisiae
800px-Yeast_lifecycle
- Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce
-
- v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie
zůstává nezměněná)
-
- lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida
- pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze
provést i tzv. random sporulation)
- u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo)

Tetrádová analýza
800px-Yeast_lifecycle
YPD
Selektivní médium
(SD-Trp ... testy)
Segregace 2:2
A A a a

Dvojité mutanty – funkční příbuznost
Mutageneze pomocí hydroxylaminu …
haploidxhaploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen
- bez fenotypu – díky wt alele (různé geny)
sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny)
      - aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad komplexu)
A
b
C
D
e
F
A
B
E
A
b
c
D
E
F
Hledání (screening) letálního mutanta – mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo
FOA)
Epistatický
Letální
D
C
F
Proteinový
komplex

Supresory
Supresory potlačují původní fenotyp – mutace téhož genu „napraví“ původní mutaci
- mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou interakci
- nadprodukce proteinu z paralelní dráhy
- nadprodukce proteinu z téže dráhy
A
b
C
D
E
A
b
C
D
E
F
F
A
E
D
C
F
F
B
E
Proteinový
komplex

JCB 131 (1995) p.1529
- mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů
(3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban)
- z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage
analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I)
... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu)

Křížení – ověření - jedna mutace
            - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.)
Ověření pravosti (mutant+delece)
Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách

YAC (yeast artificial chromosome)
»
•Bakteriální část – Amp resistence, Ori počátek replikace
•
•Kvasinková část – marker, CEN-ARS, TEL
•
•50-500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp)
•
•Klonování, množení, uchování dlouhých fragmentů DNA
•
•Výzkum savčích telomer a centromer
•
•Pomocí transfekce, lipofekce nebo elektroporace lze dostat YAC i do savčích buněk – náhodně se
integrují do genomu - výzkum nesestřihnutých genů (dlouhé regulační úseky)

Příprava aneuploidních buněk
KAR1 gen potřebný pro karyogamii tj. pro fuzi jader
a::HIS3 + a::kanMX => rezistence pouze v (a)
haploidních buňkách
Studium vlivu aneuploidie na buňku (u člověka se podílí na kancerogenezi, aneuploidie v 90%
lidských nádorů)
Torres et al, Science, 2007