Saccharomyces cerevisiae - haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (chrI=0.22 – chrXII=1.6Mbp) - délka chromosomu XII se u různých S.c. liší dle počtu (až 200) kopii rDNA v repetici (9kbp), 262 tRNA, 40 snRNA, - Krátké centromery a ARS (100bp) - Geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) - Redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi - <5% genů (220) obsahuje introny (0.5% genomu), - 3% Ty1-5 transposony (46% u člověka) - Kondenzovaný/tichý heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML Základní prvky kvasinkového genomu Centromera S. cerevisiae Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 - Sekvenčně specifická centromera se patrně vyvinula z původně repetitivní/sekvenčně nespecifické Konsensní skevence kvasinek > Centromera S. pombe - Pouze 3 chromozomy (13 Mbp = 3.5, 4.6, 5.7) - kondenzované chromozomy - geny pro heterochromatin - velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 Reinhardt a Bartel, Science, 2002 siRNA silencing Zaratiegui et al, Cell, 2007 Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek •Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné – barvení DNA na fixovaných preparátech pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole) •Použití centromerických proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium dynamiky chromatinu •TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně definovaném lokusu •ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo „ChIP on CHIP“ DAPI Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pozadí = mtDNA -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá) -na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci - SPB-GFP barvení Actin_2 DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae Image courtesy of Jonathan Millar, Division of Yeast Genetics, National Institute for Medical Research, London Separace a segregace chromosomů (centromera-kinetochora=Ndc80-GFP + SPB=Cdc11-CFP) Model separace chromosomů APC=anaphase promoting complex Uhlmann et al., Nature, 1999 kohesinový komplex (SMC=structure maintenance of chromosome) SMC1, SMC3, Scc1 a Scc3 Separasa-securin TetR-GFP TetO Použití TEV proteasy Kohesin „objímá” DNA Haering et al, 2002, Mol Cell SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (váží rapamycin) Gruber et al., Cell, 2006 Vstup DNA přes opačný konec než uvolnění Gruber et al., Cell, 2006 Uzamčení je pro buňku letální Kohesin napomáhá při opravě dvou-řetězcových zlomů v G2/M fázi Lowdens a Toh, Current Biology, 2005 Centromera DSB Evoluce kvasinkového genomu •cca 30% genomu S.c. vzniklo duplikacemi – cca 2000 genů duplikováno •srovnání kvasinkových genomů ukázalo na existenci „prakvasinky“ s 8-mi ancestrálními chromosomy (cca 4500 geny) •nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně = 15 přeskupení v genomu) • Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • ancestrální kvasinka prošla celogenomovou duplikací (WGD) 8->16 chromosomů • • •některé kvasinky některé chromosomy ztratili (např. C.glabrata = 3 chromosomy) Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • přeskupení prostřednictvím rekombinace (mikrohomologií) • • • L.k. neztratil chromosom - patrně způsobeno absencí genů DNL4, POL4, NEJ1 – důležité pro NHEJ mechanismus (oprava poškozené DNA např. dvouřetězcových zlomů, které jsou nutné pro fuze chromosomů i přeskupovaní => omezené přeskupování) - ancestrální kvasinka prošla celogenomovou duplikací (WGD) 8->16 chromosomů - poté došlo k přeskupování a redukci segmentů (i chromosomů) – 30% genomu u S.c. je pozůstatkem celogenomové duplikace (nikoli duplikace segmentů či genů) Celogenomová duplikace – S.cerevisiae Ancestrální chromosom Redukce chromosomů telomera-telomera fúzemi •např. Zygosaccharomyces rouxii ztratila 1 chromosom díky telomera-telomera fůzi 2 ancestrálních chromosomů - současně ztratily centromeru (chromosom nemůže mít 2 centromery – problémy se segregací) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 Struktura kvasinkových telomer Lowell et al., Cell Mol Life Sci (1998), p.32 300bp Repetice ~5.5kbp Telomery umlčují transkripci – ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován Cohen et al., Curr Genetics (1998), p.83 E. Blackburn, Nobelova cena, 2009 Ochrana kvasinkových telomer - musí být prodlužovány (telomerásou), jinak by se zkracovaly po každé replikaci - musí být chráněny, jinak by byly považovány za konec zlomené DNA („opraveny“ např. fůze chromosomů) - struktura telomer a subtelomer umlčuje transkripci (silencing) Represe u kvasinkových telomer - struktura telomery a subtelomery umlčuje transkripci (silencing) -např. HML a HMR lokusy jsou umlčené (pouze MAT lokus určuje párovací typ) - ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován - v průběhu evoluce některé geny mění lokalizaci a jsou jinak regulovány Aneuploidie způsobuje genomovou nestabilitu - rakovina Shelzer et al, Science (2011) - aneuploidie ve >90% rakovinných buněk - je genomová nestabilita důsledkem aneuplodie nebo je aneuploidie důsledkem genomové nestability? - - > Poškození DNA •Studium kvasinek po ozáření … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) –Ionizující záření generuje především DSB (double-strand break) –UV záření modifikuje nukleotidy tzv. TT-dimery •Chemická činidla/mutageny modifikují nukleotidy – mají za následek změnu genetické informace –MMS (methyl methan sulfonat) – (např. MMS21) –Alkylační činidla (např. EMS = ethyl methan sulfonat), ROS (reactive oxygen species) •HU (hydroxy urea) blokuje replikaci – v mutantách dochází ke kolapsům replikační vidlice (např. HUS1) => DSB • • 0721 Opravné mechanismy •Dvoj-řetězcové zlomy (DSB) –homologní rekombinace (HR) – v přítomnosti homologů (tj. sesterské chromatidy v G2 fázi, S.pombe) –nehomologní spojování konců (NHEJ) – v G1 fázi (S.cerevisiae) •Jednořetězcové zlomy, modifikace nukleotidů –Přímé opravy (specifické enzymy) –Vystřihování poškozeného úseku (BER, NER – excision repair) •Opravy chybného párování –MMR – mismatch repair (MSH1-6, MLH1-3) –Speciální polymerázy (TLS – translesion synthesis – v průběhu replikace) Oprava DSB • Lisby a Rothstein, DNA repair, 2009 > • Kolodner et al, Science (2002) rDNA - repetice •rDNA kóduje geny pro ribosomální RNA •Je vysoce konzervativní •Identifikace a odlišování kvasinkových druhů •Sledování evolučních trajektorii •Až 200 kopii v řadě za sebou •Problém s homologní rekombinací •Problém s replikací – ve stejném směru jako • transkripce (probíhá v S-fázi – kolize)