Elektroforéza •Rozdělení proteinů na základě pohyblivosti v el. poli •K realizaci je nutné mít: •Stejnosměrný el. proud •Speciální elektroforetické vany •Vhodný pufr a nosič (dříve papír, acetátcelulóza, agar) nyní agaróza polyakrylamidový gel • • Elektroforéza v imunologii molekuly s (–) nábojem ® k anodě (+) (+) nábojem ® ke katodě (–) proti zrychlení působí odpor prostředí pohyblivost molekul je dána: 1. velikostí povrchového náboje - elektrochemicky se uplatňují pouze skupiny na povrchu globule ~ KONFORMAČNÍ STRUKTURA - velmi silně se mění vlastnosti při denaturaci ~ na povrch se dostanou další skupiny ® mění se elektrochemické vlastnosti 2.velikostí molekul - větší se pohybují pomaleji ~ odpor prostředí - záleží i na velikosti síta nosiče 3. tvaru molekul - kulovité se pohybují rychleji 4. podmínkami prostředí * typ nosiče ~ agaróza, polyakrylový gel * hodnota pH tlumivého prostředí /pufru/ * iontové složení prostředí •2 způsoby elektroforézy: • · volná ~ volný elektrolyt, elektrody volně v roztoku •- po vypnutí proudu molekuly difundují zpět •® nákladné a nepřesné • · zónová ~ zvýšení viskozity prostředí, ve kterém se elektroforéza provádí •( ve vodě větší rychlost difuze než ve škrobu ) •- vytváří se tedy pórovité gely - škrob, acetylcelulóza, agar, polyakrylamid, agaróza •- směs bílkovin se nanese do míst startu, pustí se el. proud ® bílkoviny se detekují PÓROVITÉ NOSIČE jsou ponořeny do vodivého roztoku /pufru/ - funkce: přenos el. proudu - udržování konst. pH ® dělené molekuly během elektroforézy nemění náboj elektroforéza globulinů - kvalitativní a kvantitativní určení, popř. i pro separaci dělení: · podle náboje · podle velikosti molekul (Mr) Imunoelektroforetické metody -kombinace metod elektroforetických a imunodifúzních -Bílkoviny se dělí v závislosti na molekulové váze a elektrickém náboji jednotlivých molekul v přítomnosti vhodného pufru a na vhodném nosiči. Při běžné elfo se sérum dělí na zónu albuminu, α – 1, α – 2, β, γ globulinů. Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít význam při hodnocení stádia zánětlivého procesu. Při akutních zánětech stoupá zastoupení α – 1, později i α – 2, při chronických zánětech dochází ke zvýšení zastoupení γ globulinů a poklesu albuminu. •imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA •RAKETOVÁ imunoelektroforéza •PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza •DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza • Dělení - jednotlivé obloučky znamenají jednotlivé bílkoviny ® detekce až 35 sérových proteinů •Imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: •- 1953 Williams a Grabar •- 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) • vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně •po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici ® dochází k DIFUZI •® v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky • WG1 WG2 WG3 Raketová •- Laurell 1966 •- kombinace jednoduché radiální imunodifúze s elektroforézou •- monospecifická Ab + jeden Ag /či směs Ag/ c c užívá se pro zjišťování koncentrace Ag – koncentrace je přímo úměrná výšce „raketky“ kalibrační křivka: PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza •obměna jednosměrné dvojité imunodifúze, kdy je pohyb urychlován el. proudem 2 řady jamek: Ab...vždy k (–) Ag...pouze ty se (–) nábojem - v místě ekvivalence vzniknou precipitační obloučky DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza •vypracována nezávisle na sobě : 1965 Laurell a Laurellová 1966 Clair a Frieman - postup: · čistý gel + Ag – elektroforéza, rozřeže se · nanese na čisté sklíčko a zalije se gelem, který obsahuje rozptýlené polyspecifické protilátky: · v místě ekvivalence se vytvoří precipitační útvary – výška a plocha útvaru je úměrná koncentraci Ag: v séru lze detegovat až 50 proteinů Využití těchto metod: legenda: ++...velmi vhodná +.....vhodná –.....nevhodná Imunoelektroforetické metody •Využití: Imunoelfo séra se v současné době používá výhradně k průkazu monoklonálního imunoglobulinu v lidském séru – paraproteinu – monoklonální gamapatie. Je vždy produkován klonem buněk vycházející z jedné plazmatické b., mající genetickou informaci pro tvorbu jedné variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců a jedné třídy Ig molekuly. Na rozdíl od imunoglobulinů běžného séra s velkým mn. různých variabilních oblastí Ig molekul. •Praxe: Při podezdření na monokl. gamapatii se stanovuje mn. mono,-bi,-nebo oligoklonálních protilátek, které jsou produkty jednoho nebo několika málo patologicky zmnožených kmenů B lymfocytů •Paraprotein se nachází. 1. u nemocných s myelomem (nádor vycházející z plazmatických buněk) 2. při jiných malignitách lymfatického systému, 3. při chronických zánětech 4. ve vyšších věk. skupinách Imunofixace Rozdělení různých proteinů na základě jejich pohyblivosti v el. poli modifikační metodou 1.stupeň: Elfo vyšetřovaného séra 2.Stupeň: na agarózu se položí plastikované maska s výřezy, naplní se s antiséry (antiIgG, IgA, IgM, anti kappa, anti lambda), pak porovnání s precip. reakce s normálním sérem ,TSP – testovaná séra pacientů Hodnocení a)Okometricy b)denzitometricky •Výsledek: •TSP levé patologické, vpravo normální nález •Levá ELFO patologická v paraproteinu IgG, řetězec kappa •Vpravo ELFO normální •Vzniká neobvyklý pruh při klasické elfo séra, neboť paraprotein se pohybuje uniformně (stejný náboj a Mr). V určitém místě elektroforetického pruhu způsobí vysokou koncentraci Ig příslušné třídy. Při následné precipitaci s přidaným antisérem je v oblasti, kam paraprotein doputoval, výrazně více antigenu, precipitační linie je deformovaná a posunuta blíže ke žlábku s antisérem