Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2011 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 12 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: Přezůvky a plášť, protokoly, svačina V praktickém cvičení se budeme zabývat testy sledujícími aktivitu IS a) bezobratlých b) obratlovců Metody: Odběr a zpracování krve, hemolymfy; Imunodifúze - Ouchterlonyho modifikace; ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto); Test aktivity lymfocytů; rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; test ALT (stanovení aktivity jaterního enzymu), Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); Test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (HIT). Termín: 7.2.-10.2. 12 od 8.30hod Úterý 8:30 Instruktáž ke cvičení, 9.45 odběr krve z prstu, krevní roztěr příprava destiček na ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťování konc. antigenu, ředění Ag a napi petování na destičku; mezitím imunodifúze; v mezičase barvení roztěrů a krevní diferenciál; ruleta Pomůcky: ELISA: 6 destiček a dvě už hotové, Ag už sonifikované, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozto k, lednička Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test Imunodifúze: pipety, skla na imunodifúzi, vlhké komůrky, nůžky Odběr krve: rukavice, ependorfky, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na ruletu Středa 8:30 Instruktáž, ELISA: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s k aseinem, promytí destiček; v mezičase zpracování krve na sérum, ALT test, imunochromatografický test, odběr hemolymfy z larev Zavíječe voskového, kultivace s MSHP částicemi a sledování fagocytárních schopností hemolymfy, barvení rozměrů a pozorování pod mikrosko pem hemocytů, počítání FI a % F, krevní diferenciál Pomůcky: ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, promývačka ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm Fagocytóza: Leukodif, MSHP, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň Čtvrtek 8:30 Instruktáž. Test aktivity lymfocytů. Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka, v mezičase krevní diferenciál, fagocytóza hemocytů. Pomůcky: Komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální, lektin anti-H; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100 C°, vortex, stojánky na zkumavky, štítky, fixy, Pátek 8:30 samotná ELISA ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substr. roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO[4], měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO[4], ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Přehled metodik: Odběr a zpracování krve, příprava séra, stanovení krevního diferenciálu Imunodifúze - Ouchterlonyho modifikace ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. Test aktivity lymfocytů Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení Rychlá imunochromatografická metoda stanovení Helicobacter pylori - individuální stanovení Rychlá imunochromatografická metoda stanovení Chlamydia trachomatis - individuální stanovení Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk Test aktivity fagocytózy pomocí MSHP částic u fagocytů hmyzu, barvení buněk Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka (HIT)