BÍ9393 Analytická cytometric Lekce 5 Karel Souček, Ph.D. Oddělení cytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Data Analysis Vícebarevné analýzy generují mnoho dat... ■ i OUADSTATS 0 3 color 2 3 OUADSTATS 0 4 color 5 color OUADSTATS í D OUADSTATS OUADSTATS 0 ouadstats qlmdst/íts OUADSTATS ■-+ A ++ OUADSTATS OUADSTATS ouadstats ouadstats 0 OUADSTATS 0 qlmdst/íts 0 upraveno podle J.P.Robinson Analýza hlavních komponent ■ Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) je v teorii signálu sloužící k dekorelaci dat. Často se používá ke . PCA je možno najít také jako Karhunen-Loěveho transformaci nebo Hotellingovu transformaci. http://cs.wikipedia.org/wiki/Anal%C3%BDza_hlavn%C3%ADch_komponent Infinicyt? ^} cytognos Automatic Population Separator B- I Kompenzace i Kompenzace fluorescenčního signálu FITC positive & negative PE negative beads CD O CD U to CD LU HL 1000 100 10^ 1 <ľ 1000 Cl >> O to 100 10^ 1 0.1 r- tttttti i i iinii| 11 iiiii| i rrm 1 10 100 1000 r l i 111 m i 1 1000- ^ uncompensated 100^ 10 1^ 0.1 -I- 0.1 tut]—i 11 iini|—rrm 10 100 1ó00 CD3-FITC Current Protocols in Cytometry i nftTTfJ rr 10 100 1000 CD3-FITC K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu FITC positive & negative PE negative beads IOOOj 100^ 10 = 0.1 11 Huni—11 nimi—111 nni|—11 n m 10 100 1ó00 CD3-FITC Current Protocols in Cytometry K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu 1000 100 1, ° 01 LU CL 100 10-j u 0.1 Uncompensated 0 Correctly compensated ......'. ..i^. 1 '> ' I 111 M Undercompensated Overcompensated 0.1 1 10 100 0.1 1 CD3-FITC 10 100 1000 Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci Table 1.14.1 Typical Spillover Matrix for a Throe-Color Compensation^ FJ u o rop ho re Detector Green Orange Re J FITC 1.000 0.180 0.040 PE 0.009 l.OOO 0.213 PE-Cy5 0.005 0.029 1.000 "Note: The diagonal elements are I, since the contribution of eadi fitiorophoie to its cognate detector is defined to be 100%-. In this table, the FITC into PE spillover is 18%; the PE into FITC spillover is 0.9%. Current Protocols in Cytometry K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Single Cell Mass Cytometry 2D Plots ■TrWVi i*t 1 Isotope A 5* Antibodies Labeled with Elemental Isotopes Expression & Fold-Change SPADE Analysis NebulizG Single-Cell Droplets t 4 I CP-MS Elemental Analysis Mass Cytometer Upload .FCS Files Cell 1 Cell 2 Cell 3 Element AB C - - J t ' t i t ■ ■ . - r- 1,8,6,5. . . 4 9,9,4,5. . .7 Cell 1 Cell 2 Cell 3 dill _ Mass integrate Signal Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum Sean C. Bendall, et ai. Science 332, 687 (2011); Single Cell Mass Cytometry Mass Cytometry CD33 Unstimulated » □ « ICr" it CD56 IL-2 IL-10 IFNa pSTAT3 pSTAT5 r'^'lb......it.....v......i. t ] \ / I ttti^—n-riTi—.....q—r1 TTTTT-......1-.....1-^ ] 'ffiäp ™l—i—rm—.....*—r1 t fa1 : l r- \ • -5g ff (S Populations 23456789 123456789 3 Unstim IL-2 IL-6 IL-10 I § * 3 GH-CSF IFNa o ff * in Unstim IL-2 IL-6 IL-10 GM-CSF IFNa |I'STAT3 Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum Sean C. Bendall, ef at. Science 332, 687 (2011): flow cytometry data sharing and analyzing over the web U^Cytobank http://www.cytobarLk.org/nolanlab/ Aplikace průtokové cytometric ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN buněčný cyklus a ploidyta analýza zlomů DNA inkorporace BrDU exprese cyklinu analýza denaturace DNA ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU imunofenotypizace pomoci CD antigénu (detekce diferenciačních a nádorových markem) detekce cytokinových receptoru CYTOGENETIKA analýza chromozómů STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ viabilita stanovení intracelulárního pH analýza organel a cytoskeletu stanovení membránového potenciálu oxidatívni vzplanutí stanovení intracelulárního Ca2+ stanovení intracelulárních cytokinů Natural Killer ligace značených buněk analýza reportérových genů K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Biologické aplikace průtokové cytometrie ■ analýza DNA ■ analýza buněčných funkcí ■ fluorescenční proteiny K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Co je důležité při přípravě vzorku a značení... ■ Postup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit - závisí na typu buněk a konkrétní analýze - suspenze jednotlivých buněk - vitální značení - fixace (etanol, formaldehyd) - permeabilizace (detergenty) - difúze - aktivní transport Analýza bunečného cyklu • jedna z nejstarších aplikací flow cytometrie, stanovení fáze buněčného cyklu podle množství DNA • průtoková cytometrie je vhodná metoda pro rychlou a přesnou determinaci buněčného cyklu • jednoduchým způsobem je DNA obarvena fluorescenční barvou specifickou pro DNA. • Propidiurn iadide 4//6-dÍcirnÍdÍr)o-2-DhenylÍr)dole (PAPI) - dramaticky zvyšují fluorescenci po vazbě na DNA. Je nutná permeabilizace cytoplasmatické membrány . • HoechsŤ 33342 • Vybraní® DyeCycIe™ • DRAQ5 • Quaiernary benzofclohencinthridine cilkalaids ÍQBAs) I. Slaninová, J. Slanina and E. Táborská, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids—novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - mohou být používány pro značení viabilních buněk. K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Normal Cell Cycle I G0G1 Ls iG2M 1 propidium iodide DAPI Hoechst 33342 400 600 2N 4N DNA content Purdue University Cytometry Laboratories Analýza histogramu buněčného cyklu se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází 500 n £ C ä1 GoM Is . -J —Jy 200 400 DNA content i-1 0 32 64 128 160 192 224 256 DNA content Current Protocols in Cytometry TM ModFit LT An impressive new version of the industry standard. Channels 0 iü Channels 200 260 Verity Software House^^ MultiCycle for Windows Advanced DNA Cell Cycle Analysis Program MultiCycle AV fits 6 different cell cycle models automatically. The variability in results is one aid to assessing confidence in S and G2 phase estimates. Display of statistics is optional. Fib E ill tasfcu ürfcra Vew Wribw Hdp jaffl -ln|a|g)|*a ^UI-UI^I-^I .juunj^iciiial tf|g|i|H--|^|.-|-Jp-l = -l-=:M^lU ASCII.1 UuHiCjcIf Mi^fstioibs (a guideline only): An nneuploid DN-4 content is observed. rhfiiieupU.H «S=17>4, %Gz=n.7 rb# & Phase conflu'eiice Is good k ue let DNA Content DIPLOID CYCLE MsanGl= 65.507 CVG1= 1.41 S SG1 = B9J106 M«nCI-126.413 CVG1- JUS ^G2= D.064 t¥S? = lO.jm ANEUPL. CYCLE MhhC1= in?32S CVG1= 3.475 91 Gl-70330 Ms>m [Ca2+]m <=> ATm => apoptóza K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie o o o o o 00 ionophor 1 o o o o o ■ 00 DMSO/96h -1 £ LL. ■ ■—■ 'jZ' O O ■ 0\l 200 400 600 S00 Time (102.40 sec.) 1000 ionophor Ca 2+ influx 200 400 600 800 Time (102.40 sec.) - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-l 1000 1 Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]j •standardizace barvení a kalibrace •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic®-127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Kalibrace (pro jednu vlnovou délku) [Ca*] = Kdx£^4 V max / HL60/-/72h ~\wi\ 111111111111111111111 0 200 -100 600 800 1000 FSC-Height d d d .—.o to. Too -ío O Do jo. ll m HL60/-/72h t i i i i i i 200 i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—p 400 600 Time (20480 sec/ 800 1000 Time (204.80 sec.) (8) vs FLUQ-3 AM (FL1-H) (3) MllCl2 1 TI. \ ionomycin Fmax ■% FMnCI: Time Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) '"min - 1 -25 x FMnC|2 - 0.25 x Fmax K. Souček BÍ9393 Analytická cytometrie Detekce intracelulárního pH ■ Fluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH ■ SNARF-1, BCECF G: G:A G:A G:A FALS 580 nm 640 nm Ratio 640/580 Detekce intracelulárního pH ■ Nutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) 7.0 7.2 7.4 7.6 7.S 8.0 pH Detekce počtu buněčného dělení ■ Nespecifické fluorescenční označení proteinů pomocí carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE nebo CFSE) Detekce reaktivních kyslíkových skupin ■ Reaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů - posttranslační modifikace proteinů - regulace transkripce - regulace struktury chromatinu - přenos signálu - funkce imunitního systému - fyzický a metabolický stres - neurodegenerace, stárnutí 4 e- reduction to water 02 — 02«- — H202 — «OH — H20 \ \ I Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme bound Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc... Simon Melov Potential sites of intervention Mitochondrial Damage DNA Damage Energy Crisis Cell Death Neurodegeneration Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Oncogenesis \ immune Function Cancer Simon Melov Hydroethidine H2N-C >-e >NH2 02" H- NH, s CH2CH3 Phagocytic Vacuole NADPH Oxidase Example: Neutrophil Oxidative Burst 'J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH 2',7'-dichlorofluorescin diacetate O O ■ ■ CH3-C- C-CH3 2',7'-dichlorofluorescin Hydrolysis (^f Cellular Esterases C CI COOH 2o2 DCFH-DA Oxidation E. Neutrophils Monocytes M Lymphocytes ~üt Ii » « íi ií" « Sut Fluorescent 2',7'-dichlorofluorescein HO O o Cl H Cl COOH 80 Control ^ PMA-stimulated PMN iJjJx._ log FITC PluoresceVifce 1000 ©J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DHR-123 HE Oxidative Burst 10 10' 10" 10 DCFH-DA (FL1-H) 10 10 10' 10" 10-DHR-123(FL1-H) 10 10 10 102 103 HE (FL2-H) 10 Key Name — ATRA/72h+PMA — NaBT/72h+PMA vit. D3/72h+PMA K. Soucek Bi9393 Analyticka cytometrie The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Photo: J. Henrrksson/SCANPIX Osamu Shiimomuna O 1/3 of the prize USA Marine Biological Laboratory (MBL) Woods Hole, MA, USA; Boston University Medical School Massachusetts, MA, USA Photo f I. Henri ksson/SCANPIX Martin Chalfte 0 1/3 of the prize USA Columbia University New York, NY, USA Photo: LTCSQ Roger Y. Tsien ® 1/3 of the prize USA University of California San Diego, CA, USA; Howard Hughes Medical Institute M b. 1928 (in Kyoto, Japan] b. 1547 b. 1952 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescenční proteiny ■ bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. - je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. - modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis- korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. - luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působen luciferázy. - modré světlo excituje green fluorescent protein. Aequorea victoria "Crystal jelly " Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/livmg_species/default.asp?hOn=l&mhab=440 http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny ■ Osamu Shimomura -1961 objevil GFP a aequorin http://wwwxomcoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Fluorescenční pr Douglas Prasher Martin Chalfie Science. 1994 Feb 11 ;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. ■ A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny http://wwwxomcoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm in vivo molekulární vizualizace KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging Syste KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7:1336-1340, 2000. Fluorescenční proteiny Sergey A. Lukyanov - Objevil „GFP-like" proteiny u nesvětélkujících korálů © 1999 Nature America Inc. ■ http://biotech.nature.com Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species Mikhail V. Matz, Arkady F. Fradkov, Yulii A. Labas1, Aleksandr P. Savitsky2, Andrey G. Zaraisky, Mikhail L. Markelov, and Sergey A. Lukyanov* Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Acadmy of Science, 117871 Moscow, Russia. 'Institute of Ecology and Evolution, and2 Institute of Biochemistry Russian Academy of Science, 1707! Moscow, Russia. ^Corresponding author (e-mail: luk@ibch.siohc.ras.ru}. Received 28 May 1999; accepted 18 July 1999 Roger Tsien ■ ~ 2002 - mutace FP = barevné spektrum http:/A/vww.tsienlab. ucsd.edu/ W> T %4&A ~~---- ■ . ^^^^^^^ 2^ i ffffivf vfvviH ™rnm o 232223 = 2233 1 7 9 Si = d E? £ č' s a 1 y ? g 2 1 1 ^ VOLUME 3 I DECEMBER 2002 Table 1 I Properties of the best FP variants3 h Class Protein Source laboratory (references) Excitation1-(nm) Emission11 [nm) Brightness6 Photostability* pKa Oligomerization Far-red mPluma Tsien {5} 590 649 4.1 53 <4.5 Monomer Red mCherryg Tsien (4) 587 613 16 96 <4.5 Monomer tdTomatos Tsien (4) 554 581 95 9B 4.7 Tandem dimer mStrawberrya Tsien (4) 574 596 26 15 <4.5 Monomer J-Red^ Evrogen 584 610 8.8- 13 5.0 Dimer DsRed-monomerh Clontech 556 586 3.5 16 4.5 Monomer Orange mOrange^ Tsien (4) 548 562 49 9.0 6.5 Monomer mKO MBL Intl. (10) 548 559 31* 122 5.0 Monomer Yellow-green mCilrine' Tsien 06,23) 516 529 59 49 5.7 Monomer Venus Miyawaki (1) 515 528 53* 15 6.0 Weak dimerJ YPet3 Daugherty (2) 517 530 80' 49 5.6 Weak dimer1 EYFP Invitrogen (18) 514 527 51 60 6.9 Weak dimerJ Green Emerald? Invitrogen (18) 487 509 39 0.69k 6.0 Weak dimer' EQFP Clontech1 488 507 34 174 6.0 Weak dimerj Cyan CyPet Daugherty (2) 435 477 18* 59 5.0 Weak dimerj mCFPmm Tsien (23) 433 475 13 64 4.7 Monomer Cerulean^ Piston (3) 433 475 27' 36 4.7 Weak dimer1 UV-excitable green T-Sapphires Qriesbeck (6) 399 511 26* 25 4.9 Weak dimerJ *An expanded version of this table, including a list of other commercially available FPs. is available as Supplementary Table 1. 'Trie mutations of all common flFPs relative to the wild-type protein are available in Supplementary Table 3. 'Major excitation peak. dMajor emission peak. "Product of extinction coefficient and quantum yield at pH7.4 measured or confirmed (indicated by *) in our laboratory under ideal maturation condition;, in (rnM • cra)-1 (for comparison, free fluorescein at pH 7.4 ha; a brightness of about 69 (mM • cm)-1). 'Time for bleaching from an initial emission rate of 1,010 photons/s down to 500 photons/s (tl;e: for comparison, fluorescein atpH 8.4 has tleof 5.2 s); data are not indicative of photostability under focused laser illumination. 'Brightest in spectral class. "Not recommended (dim with poor folding at 37 *C). 'Citrine YFP with A216K mutation: spectroscopic properties equivalent to Citrine. 'Can be made monomeric with A206K mutation. "Emerald has a pronounced fast bleaching component that leads to a very short time to 50% bleach. Its photostability after the initial few seconds, however, is comparable to that of E'jFP. 'Formerly sold by Clontech. no longer commercially available. mECFPwith A206K mutation; spectroscopic properties equivalent to EGFP. A guide to choosing fluorescent proteins Nathan CSIlanei 1J, I'jml A SlMiihath1-3 & Rligf r YTurn 1 J4 I VOL 2 NO. 1 2 I DECEMBER 2005 I ■l- ť e v - CH Debris Aggregates □ DipG1 □ DipG2 □ DipS I I I | I 100 150 Channels I n i i | ii ii | i 100 150 200 Channels Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu 50 1—l—l—l l^ľ^^^^^^Ť I 11 11 I 100 150 Channels 200 250 Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells mKO2-Cdtl(30/120) niAG-Gemininl 1,110] IBS Proteosome Paly'Ubiquitin chain Chemistry & Biology 15, February 2008 ©2008 Elsevier Ltd Ubiquitin E3 ligase complexes Gl - APCCdhl S, G2, M- SCFSkP2 Nature Methods - 5, 283 (2008) Fucci mK02 hCdtl (30/120) riAG-hG&m (1/110) +DIC BrdU g1 gi ;s s g2 M 1 % / * Pi ■ mK02(+)mAG(-} mK02(+)rriAG(+) 500 400 £3 o o — 200 O 100 mK02(+)mAG{-) ,mK02(+)mAG{+) Flu. intensity of mAG 200 400 600 &00 1000 Hoechst 33342 Resource Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multicellular Cell-Cycle Progression Asako SakauB-Sawano,1-3 Hiroshi Kurokawa,1 ^ Toshifumi Morimura,2 Aki Hanyu,5 Hiroshi Hama,1 Hatsuki Osawa,1 Saori Kashiwagi,2 Kiyoko Fukarni,1 Takaki Miyata,0 Hiroyuki Miyoshi,7 Takeshi Imareura,5 Masaharu Ogawa,2 Hisao Masai,B and Atsushi MiyawakM-3 ' ■■Laboratory for Cell Function and Dynamics ^Laboratory for Cell Culture Development Advanced Technology Development Group, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wakc-city, Saitama 351 -0103, Japan 3Life Fjnction and Dynamics* ERATO, JSTP 2-1 Hirosawa. Wako-city, Saitama 351-0198, Japan 4School of Life Science, Tokyo University of Pharmacy and Life Science, 1435-1 Horinouchi, Hachioji, Tokyo 102-0390, Japan departments of Biochemistry, The Cancer Institute of the Japanese Foundation for Cancer Research, 3-10-6 Ariake, Koto-ku, Tokyo 135-8550, Japan ^Department of Anatomy and Cell Biology, Nagcya University Graduate School of Medicine, 65 Tsururnai-cho, Syowa-ku, Nagoya, Aichi 466-6550, Japan 'Subteam for Manipulation of Dell Fate, BioResource Center, RIKEN Tsukuba Institute, 3-1-1 Koyadai, Tsukuba, Ibaraki 305-0074, Japan ^Genome Dynamics Project, Tokyo Metropolitan institute of Medical Science, 3-13-22 Honkomagome, Bunkyo-ku, Tokyo 113-3613, Japan 'Correspondence: matsushi@brain.riken.jp DOI I0.10l6^.cell.2007.12.033 shRNA for TTL Bgln [5215] 13ml fed?) 5arll (4grjo) WRE Laopnun rev 3'UxP eotei (4349] Ventura, Meissner, Dillon, McManus, Sharp, Van Parijs, Jaenisch and Jacks PNAS 2004 "Cre-lox regulated conditional RNA interference from transgene". PRE FECI C2430) v / Loop oulfar -6 3rDmo1cr J LojcP stiRNA ckinimg she ■BamHI C297O HtatltagSj] shRNA elements: TTL—1 tgcatcaaataagcatgagattccaagagatctcatgcttatttgatgc ttttttcacgtagtttattcgtactctaaggttctctagagtacgaata aactacgaaaaaagagct TTL—2 tggcaacgtttggattgcaattccaagagattgcaatccaaacgttgcc ttttttcaccgttgcaaacctaacgttaaggttctctaacgttaggttt gcaacggaaaaaagagct CHV-GF3 iu*r pSicoR active DSIN-LTR[]~PErTl cPPT 1 |^>U^hRNgJMtfTj^ SIN-LTRp I + Ore IrjxP inactiveD5in-ltrlT~P3J [~[cfpt] whe □5jn-ltrTI Pz-HPV-7 cells - shRNA for TTL (Lentivirus infection) DIC merge TTL-2 in vivo molekulární vizualizace KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging Syste KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7:1336-1340, 2000. in vivo molekulární vizualizace u c o 3 9L-GFP 9L-RFP 9L-GFP J* 9L-RFP LL O 3 u. c o ü White light 9L-RFP 9L-GFP MJSCI9 Fluorescence 9L-RFP 9L-GFRA Muscle \- Color-coded fluorescence 9L'RFP Muscle 9L-GFP W w ill -RFP 9L-GFP i Muscle * * 0* In vivo imaging of siRNA delivery and silencing in tumors VOLUME 13 | NUMBER 2 | MARCH 2007 NATURE MEDICINE Zdravka Medarova1,3, Wellington Pham1'3, Christian t'arrar1, Victoria Petkova- & Anna Moore1 Targeting proteins & fluorophores The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function Smi N G. 660 Fluorophore: Hoechst GFP QD565 ReAsH Cy5 Targeting: direct affinity genetic immuno genetic immuno Target: DNA ü-tubulin giantin a -actin Cytochrome c Structure: nuclei microtubules golgi stress fibers mitochondria — The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function 8m N. G. GiepmaiH.12 Siephtn R. Adanw,2 Mirk H. Ellisman.1 Roger Y. Tsi«n21* SCIENCE VOL 31 2 14 APRIL 2006 biarsenical-tetracysteine systém ■ Nefluorescenční, membránově permeabilní biarsénová značka vytváří kovalentní fluorescenční komplex s jakýmkoliv intracelulárním proteinem obsahujícím krátký tetracysteinový motiv (CCPGCC) biarsenical-tetracysteine system ^Miijca dye......C^cKA^... HAaH __ Fte^sH Tslracystetre- 360 50a E93 camp*}* axeiiaiieri maximum (nm) Tenacysteme- 430 523 606 amptax emission manmjm[nm) Nature Reviews | Molecular Cell Biology tile I ted rinoiogies- @ invitrogen Click azide/alkyne reaction Metabolically or enzymatically azide-modified protein Cu(l), 1 hour Room temperature TAMRA, Dapoxyr9, or biotin alkyne Stable triazole conjugate m iso