Příprava krevního roztěru příprava roztěru Správně Příliš tlustý Moc krve Nerovnoměrný tah Třásla se ruka Krev se srážela Mastné sklíčko Barvení roztěrů nStandardním barvením pro krevní nátěry je tzv. panoptické barvení dle Pappenheima. nPostup barvení: n n1. Celý nátěr na 3 minuty pokryjeme May-Grünwaldovým barvivem. n n2. Opatrně přikapáváme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo nesmylo. Cílem je nechat působit takto naředěné barvivo (1:1) další 1 minutu. n3. Barvivo slijeme, můžeme opláchnout vodou. n4. Na nátěr naneseme Giemsa-Romanowského barvivo. Toto barvivo musí být před barvením vždy čerstvě naředěné přibližně 1:9 (na 10 ml destilované vody 10 - 15 kapek barviva). Necháme působit přibližně 15 minut (10 - 20 minut). n5. Barvivo slijeme a důkladně opláchneme pod tekoucí vodou. n6. Spodní stranu sklíčka očistíme utěrkou. n7. Je vhodné ihned zkontrolovat probarvenost krevních buněk a eventuelně preparát ještě dobarvit. Barvení pomocí hotových barvicích sad nVýhody: nrychlé (cca 1 – 2 min) nroztoky již připraveny nvydrží dlouho (měsíce) nze skladovat při pokojové teplotě npoužívají se opakovaně n nNevýhody: nNeposkytují tak dobré výsledky jako klasické barvící techniky nVe výzkumu nebo při hodnocení sporných patologických nálezu je lepší použít klasické techniky, přestože jsou časově náročnější Příklady: barvící sada Leukodif (Pliva Lachema) Diff-Quik ( Medion Diagnostics) Postup barvení : Roztěr musí být suchý 1.Fixační činidlo (metanol) 5 x 1 s 2.Eozin 5 x 1 s 3.Azur 5x 1 s 4.Oplach (fosfátový pufr pH 7,4 nebo dest. voda) 5. Nechat zaschnout a pozorovat pod imerzí Mezi jednotlivými kroky neoplachujeme ani nesušíme Vyhodnocování krevního roztěru • Pozorujeme zásadně pod imerzí • • Správná oblast pro hodnocení: kde se krvinky příliš nedotýkají • V této oblasti prohlížet preparát při tzv. meandrovitém pohybu (C) • Krevní diferenciál (dif): procentické zastoupení jednotlivých typů leukocytů • • Krevní obraz: kompletní hodnocení počtu a morfologie formovaných krevních elementů • Orientační pomůcka: na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů • schéma počítání Úkoly: nPřipravit cvičný roztěr z myší krve (jeden nebo více) n nObarvit myší roztěr a orientačně prohlédnout – nevyhodnocovat !!! n nVyhodnotit učitelem dodaný roztěr lidské krve: n n Zakreslit jednotlivé typy krvinek (erytrocyt, trombocyty, 5 typů leukocytů) n n Vyhodnotit diferenciál (u 50 leukocytů určit typ a vypočíst z toho jejich procentické zastoupení). n n Srovnat určený diferenciál s fyziologickými hodnotami, které je nutné vyhledat v textu ve složceJ n n n nV mezičase se seznámit s manipulací s automatickými pipetami Popis formovaných krevních elementů nGranulocyty: n nv cytoplasmě mají granula, jádro bývá segmentované n •Neutrofil: velikost 10 – 12 μm, cytoplasma se barví slabě růžově, jádro tmavě modré, segmentované (2 – 7 segmentů) Průměrný počet segmentů se vyjadřuje pomocí Hynkova čísla, které odráží stupeň zralosti neutrofilů. Granula se barví kyselým i zásaditým barvivem a mají proto nevýraznou narůžovělou barvu, jsou velmi malá, sotva rozlišitelná. Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza cizorodých částic a jejich rozklad pomocí lyzosomárních enzymů. n n Neutro012tn Neutro050tn Neutro045tn •Eozinofil: velikost 12 – 14 μm, jádro ze dvou segmentů (brýlovité), granula větší než u neutrofilů, barví se cihlově červeně. n Hlavní funkcí eozinofilů je obrana proti endoparazitům a mohou se účastnit i alergických reakcí n • Bazofil: velikost 9 - 11 μm, jádro protáhlé, často esovité, granula tmavě modrá, velká, barví se stejně jako jádro, proto se jeví jakoby jádro překrývala. Bazofily se účastní alergických reakcí. eosino001tn eosino002tn eosino003tn Baso001TN Baso002TN Baso003tn Popis formovaných krevních elementů nAgranulocyty: n nv cytoplasmě nemají granula, jádro není segmentované n •Lymfocyt: velikost 6 – 12 μm podle stupně zralost (malí, střední a velké lymfocyty) , jádro okrouhlé hodně tmavé. Při diferenciaci (zrání) buňky přibývá cytoplasmy, jádro je stejné. Granula v cytoplasmě nejsou pouze drobná zrnitost. V roztěru nerozlišíme T a B lymfocyty, vetšina v periferní krvi jsou B lymfocyty. Hlavní funkce T lymfocytů je kooperace s dalšími imunitními buňkami při likvidaci cizorodých látek. Hlavní funkcí B lymfocytů je produkce protilátek. lympho002tn lympho003tn lympho004tn nMonocyt: velikost 14 – 20 μm, kulaté nebo oválně, jádro často n ledvinovitého tvaru (záleží na směru pozorování). Chromatin je jemně zrnitý, jádro je vždy světlejší než u lymfocytů. Granula nejsou, cytoplasma se však může jevit jako mírně zrnitá. Hlavní funkcí je fagocytóza cizorodých částic za účelem jejího zpracování a předložení dalším buňkám imunitního systému. mono002tn mono003tn mono001tn Popis formovaných krevních elementů nErytrocyty: velikost: 7 μm. Savčí erytrocyty jsou bezjaderné, oblast kde jádro před dozráním bylo se jeví jako světlejší disk. Erytrocyty ostatních tříd obratlovců jsou většinou oválné a mají vždy jádro. n nTrombocyty: krevní destičky, u savců jsou bezjaderné, jsou to vlastně odškrcené okrsky cytoplasmy z buněk, které se mazývají megakaryocyty a jsou trvale v kostní dřeni. Tyto okrsky cytoplasmy mají velikost asi 3 μm a často v roztěrech vytvářejí shluky. Trombocyty ostatních obratlovců jsou jaderné. ptačí trombocyty savčí trombocyty trombocyty neutrofil eozinofil bazofil lymfocyt monocyt Granulocyty neutrofil eozinofil bazofil Agranulocyty lymfocyt monocyt Použité zdroje: nAtlas Hematologie zvířat: http://projekty.sosvet.cz/2006_hematologie/index.htm nTichý a kol: Histologie, VFU Brno, 2000 n n