Molekulární fyziologie živočichů Vítězslav Bryja Ústav experimentální biologie PřF MU & Biofyzikální ústav AV ČR Růstové faktory z rodiny Wnt ve fyziologii Wnts (Wingless/Int) - family of ligands - 19 members in human and mouse - glycosylated and palmitoylated extracellular proteins - short range of action, bind to extracellular matrix - only in multicellular animals canonical (eg. Wnt-1 or Wnt-3a) non-canonical (eg. Wnt-5a) Wnt/b-catenin dráha (= kanonická dráha) - např. Wnt-1 nebo Wnt-3a - induce axis duplication in Xenopus - induce transformation of mammary cell line C57mg -signal via nuclear translocation of b-catenin - frogs Příklady vývojových a fyziologických procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Maternální Wnt/b-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya maternal Wnt in Xenopus xenopus_gastrulation_2 axis duplication assay: embyrevisedembedded frogs Wnt/b-cateninová dráha určuje anterioro-posteriorní (AP, předo-zadní) osu těla během gastrulace – podporuje vznik zadních a blokuje vznik předních částí těla maternal Wnt in Xenopus Uncx4 myší embryo po gastrulaci (E8.5): Cílové geny Wnt/b-cateninové dráhy jsou exprimovány v zadní části těla. Deplece Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout Wnt/b-cateninová dráha je klíčovým regulátorem aktivace kmenových buněk jak v embryogenezi, tak v dospělých tkáních Wnt/b-catenin dráha je velmi často deregulovaná u nádorů! according to Beachy et al., Nature 2004 Aktivace b-cateninu ve vyvíjející se mozkové trubici: Chenn & Walsh, 2002: Science;297:365-369. Zechner et al., 2003: Dev. Biol.;258:406-418. midbrain (Brn4-promotor) cortex (nestin enhancer) Järvinenet al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 18627-18632 Aktivace beta-cateninu v kmenových buňkách zubu: Reya & Clevers 2005, Nature Lo Celso, C. L. et al. Development 2004;131:1787-1799 Důsledky aktivace b-cateninu v epidermis (po depilaci) Aktivace kanonické Wnt dráhy indukuje de novo tvorbu vlasových kořínků Moore & Lemischka, Science, 2006 Wnt signalizace v normální a patologické fyziologii střevního epitelu Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) A. Příprava transgenní myši č. 1 za účelem zjistit, kde je nový potenciální stem cell marker exprimován (in vivo expression profiling). Lgr5 je exprimován specificky v buňkách ve spodní části krypty. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) B. Příprava transgenní myši 2, 3 a 4 za účelem zjistit, co všechno vzniká z Lgr5-pozitivních buněk (Lgr5+ lineage tracing). Lgr5 pozitivní buňky dávají vzniknout všem částem buněčného epitelu. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature & Sato, Nature 2009) C. Lgr5 pozitivní buňky in vitro dávají vzniknout kompletní villus-crypt struktuře in vitro (Doposud se to s žádnými jinými buňkami nepodařilo) Experimentální důkaz: Vznik malých adenomů, které neprogredují Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Nekontrolovaná aktivace kmenových buněk má fatální následky Rychlý vznik adenomů a nádorů Zkříažení s APC flox/flox myšima + tamoxifen DMBA-TPA induced tumors DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis - benign papilomas, which in some cases progress into squamous cell carcinoma (SCC) DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis Malanchi et al. 2008, Nature CD34+ CD34- Malanchi et al. 2008, Nature Wnt/b-cateninová dráha v regeneraci II. regenerace chick axolotl Wnts in fin regeneration zebrafish Wnt/b-cateninová dráha v regulaci stárnutí Klotho myš -mutantní kmen myši s fenotypem akcelerovaného stárnutí: např. kratší život, arterioskleróza, snížená plodnost nebo kožní atrofie - protein Klotho je transmembránový protein s velkou extracelulární doménou, ta může být odštěpena a volně cirkulovat v krvi aktivita Wnt/b-cateninové dráhy ve střevním epitelu Model 1 – svalová fibróza - s prodlužujícím se věkem stále častěji při regeneraci svalu vznikají místo svalových buněk buňky fibrózní tkáně – tak přispívají k nižší výkonnosti svalu, která souvisí se stárnutí Model 2 – parabiotické párování Fyzické propojení dvou krevních systémů (a tím i dvou vnitřních prostředí) u myši dbmouse BrdU Nekanonická Wnt dráha - e.g. Wnt5a - do not induce axis duplication in Xenopus - do not induce transformation of mammary cell line C57mg - do not signal via nuclear translocation of b-catenin - frogs-gastrulation Drosophila – PCP (planar cell polarity) PCP scheme drosophila wing Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) pathway: phenotypes in mouse Stereocilia orientation in inner ear hair cells Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) in mouse (and human) convergent extension Možnosti studia konvergentní extenze - Kellerovy explantáty (Xenopus) CE control XLRP5 MO XLRP5 MO + mLrp5 exencephaly Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencephaly Hamblet et al., 2002, Development Open neural tube Known Wnt5a knockout phenotypes E 18.5 +/+ -/- Yamaguchi et al., 1999 Qian et al, 2007 RRS BDB ror2 1740-1774del35 N620K W720X C182X R184C R189W R205X R366W R396X Q502X 1321-1325del(5) IVS8+3+5del3ins19 1398-1399insA W749X 2249delG Y755X Q760X Mutations in Ror2 cause dominant brachydactyly type B (BDB) and recessive robinow syndrome (RRS) Hari, L. et al. J. Cell Biol. 2002;159:867-880 neural crest I. Vývoj neurální lišty: - neurální lišta je zdrojem periferního nervového systému, melanocytů, obličejových kostí a svalů, srdce a dalších Wnt3a in NC Wnt-3a Kanonické a nekanonické Wnt signálování často regulují odlišné části téhož vývojového procesu. Henderson DJ et al., 2006, TrendsCard. Res. Heart outflow tract development Vincan, 2004, Frontiers in Bioscience Fundamental question of Wnt signalling: How the specificity is achieved?