Transformující růstový faktor – b: rozmanitost přenosu signálu a funkce část 1. Karel Souček Bi6051 Molekulární fyziologie živočichů TGF-b rodina je důležitá v regulaci procesů raného vývoje, … [USEMAP] TGF-b2 Heupel et al. Neural Development 2008 3:25 Goumans et al. Development 1999:126 …a pro udržení homeostázy ALK1 mutation => Clinical symptoms of hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) include (A) bleedings in tongue and lower lip, (B) arteriovenous malformations (pulmonary angiogram is shown), and (C) nasal telangiectases (courtesy of Dr U Geisthoff). Cell Research (2009) 19:116 Placencio VR, Sharif-Afshar A-R, Li X, et al. 2008. Stromal transforming growth factor-beta signaling mediates prostatic response to androgen ablation by paracrine Wnt activityTGF-beta responsiveness of the stroma dictates prostatic sensitivity to androgen ablation. Cancer Res 68:4709-4718. Li X, Placencio V, Iturregui JM, et al. 2008. Prostate tumor progression is mediated by paraacrine TGF-beta/Wnt3 a signaling axis. Oncogene 27:7118-30. Joan Massague, Cell 134, July 25, 2008 Signálová transdukce: základní principy Cover of Molecular Biology of the Cell http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/ Signálová transdukce: základní principy n Komunikace mezi buňkami Øpříjem signálu Øpřenos signálu uvnitř buňky Øzměna chování (fenotypu) na základě zpracování signálu (ů) Jednoduchá intracelulární signální dráha aktivovaná vnější signální molekulou ovlivňuje odpověď buňky. Signální molekula receptor Intracelulární signální dráha vazba aktivace Cílový protein (komplex proteinů) Změna chování (fenotypu) buňky Základní principy: signální molekuly a jejich receptory ØBuňky mohou komunikovat prostřednictvím řady různých molekul Příklady různých signálních molekul: Proteiny, malé peptidy, aminokyseliny, retinoidy, mastné kyseliny a jejich deriváty, plyny ØSignální molekuly jsou produkovány signalizující buňkou ØBez ohledu na typ signálu odpovídá cílová buňka pomocí receptoru který specificky váže signální molekulu a iniciuje vlastní odpověď. ØExtracelulární signál -rozpoznán pomocí specifického receptoru. vhydrofilní: neprojde plazmatickou membránou – vazba na povrchový receptor příklad: růstové faktory vhydrofóbní: prochází buněčnou membránou a přímo reguluje aktivitu intracelulárního receptoru. -transportován pomocí nosiče příklad: steroidní hormony, vitamin D Základní principy: signální molekuly a jejich receptory buňka buňka Ø Každý buněčný typ je „naprogramován“ odpovídat na specifickou kombinaci signálních molekul. Typická savčí buňka je vystavena kombinaci stovek různých signálů -selektivní odpověď ØKaždá buňka má určitý set receptorů ØSignální molekuly mnohdy fungují v kombinaci s dalšími Zakládní principy buněčné signalizace nTři skupiny proteinových povrchových receptorů: Øspřažené s iontovými kanály Øspřažené s G-proteiny Øspřažené s enzymatickou aktivitou 15_015 15_015_2 Buněčné povrchové receptory ØAktivovaný povrchový receptor spouští kaskádu fosforylací vedoucí k přenosu signálu buňkou až k jádru. ØPůsobí jako přenašeče signálu: vážou signální molekulu s vysokou afinitou a konvertují tento extracelulární signál a jednu nebo více intracelulárních signálních drah vedoucí k odpovědi na buněčné úrovni (změna fenotypu atp.). Receptory spřažené s iontovými kanály 11_021 Receptory spřažené s G-proteiny 15_028 15_026 Receptory s tyrosin kinázovou aktivitou n Øtransmembránové proteiny z doménou vázající ligand na vnější straně a katalytickou doménou na vnitřní straně buněčné membrány n ØVazba růstových faktorů jako je insulin, epidermální růstový faktor na extracelulární část jejich receptoru vede k aktivaci kinázové aktivity katalytické domény receptoru a spouští fosforylaci substrátů přenášejících signál. Hlavní mechanismy přenosu signálů mají podobné principy ØJak u tyrosin kinázové signalizace tak u G-proteiny zprostředkované signalizace je signální protein aktivován fosforylací a deaktivován defosforylací. Signaling by phosphorylation Signaling by GTP-binding protein 15_017 Signálová transdukce: shrnutí obecných principů ØBuněčná signalizace vyžaduje jak extracelulární signální molekuly tak komplementární set buněčných receptorů a intracelulárních přenašečů ØVětšina signálních molekul je hydrofilní a aktivuje povrchové buněčné receptory ØExistují tři hlavní skupiny povrchových receptorů. ØPrecizně regulovaná kaskáda fosforylací stimulovaná aktivací receptoru vede k přenosu signálu skrz cytoplasmu do jádra. n Signální molekuly - ligandy -hydrofobní -hydrofilní Receptory - specifické - intracelulární - povrchové (extracelulární) Receptory spřažené s iontovými kanály Receptory spřažené s G-proteiny Receptory spřažené s enzymatickou aktivitou Oncogene (2005) 24, 5742–5750 Transforming growth factor -b (TGF-b) TGF-b rodina ~ TGF-bs, activins, bone morphogenic proteins (BMP) TGF-b1 • pleiotropní cytokin • negativní regulátor Epstein, F.H., N Engl J Med 2000; 342:1350-1358, 2000 Biologické funkce TGF-b nReguluje proliferaci, diferenciaci, buněčnou smrt, motilitu, adhezi (v závislosti na buněčném typu) = ovlivňuje homeostázu; n reguluje expresi extracelulární matrix; –indukuje fibrilární kolagen a fibronectin; –inhibuje degradaci ECM (prostřednictvím inhibice MMPs a indukce TIMPs). Biologické funkce TGF-b nTGF-b1 knockout –Multifocal inflammatory disease followed by a wasting syndrome • Multifocal infiltration of lymphocytes and macrophages into diverse organs. Increased adhesion of mononuclear leukocytes (MLN) to extracellular matrix and to endothelial cells in vitro. Blockage of MLN infiltration by synthetic fibronectin peptides • Decreased thymus size • Enlargement of lymph nodes • Elevated constitutive levels of IL-2 mRNA in the thymus • Elevated IL-2r mRNA in lymph nodes – Cachexia Death roughly 20 days after birth – nTGF-b2 knockout –Multi-organ defects (lung, heart, limb, craniofacial, spinal column, eye, inner ear, urinary tract, genital tract) –Perinatal mortality http://www.bioscience.org/knockout/knochome.htm Regulace růstu/proliferace a zrání/diferenciace hematopoetických buněk působením TGF‑b N.O. Fortunel, A. Hatzfeld, J.A. Hatzfeld, Transforming growth factor-beta: pleiotropic role in the regulation of hematopoiesis, Blood 96 (2000) 2022-2036. Transforming growth factor-b family nHistorie nZástupci rodiny a jejich nejvýznamnější funkce nSyntéza, produkce a aktivace nPřenos signálu a jeho regulace –receptory –sekundární přenašeči –„alternativní“ dráhy –regulace genové exprese nRole v rozvoji patologických stavů n – Historie TGF-b nna konci 70. let byla identifikována celá řada růstových faktorů; nbylo zřejmé, že nádorové buňky se liší od normálních buněk mmj. ve schopnosti reagovat na některé z nich; nRobert Holley ( 1968) naznačil, že transformované nebo nádorové buňky unikají z normální růstové kontroly tím, že potřebují méně hormonů či růstových faktorů; nMichael B. Sporn vyslovil v roce 1980 hypotézu o možném podílu autokrinních faktorů na buněčné transformaci nobel_medal [USEMAP] [USEMAP] Endokrinní, autokrinní & parakrinní regulace Untitled-1 Sporn, M.B. 2005 The early history of TGF-b R&D Systems [USEMAP] Historie TGF-b nTodaro a De Larco (1978) popsali „faktor“ způsobující transformaci normálních buněk – pojmenovali ho sarcoma growth factor (SGF) Historie TGF-b nA.B. Roberts a M.A. Anzano (1982) prokázali, že SGF není jen jeden faktor –Frakce indukující málo kolonií a silně kompetitivní s EGF= TGF-a –Frakce indukující mnoho velkých kolonií a bez kompetice s EGF = TGF-b Cancer Res. 1982 Nov;42(11):4776-8. Synergistic interaction of two classes of transforming growth factors from murine sarcoma cells. Anzano MA, Roberts AB, Meyers CA, Komoriya A, Lamb LC, Smith JM, Sporn MB. Historie TGF-b nNa začátku 80. let byli vyvinuty metody purifikace TGF-b nV té tobě již bylo jasné, že produkce TGF-b není nádorově specifická npurifikace zejména z placenty, krevních destiček a prasečích ledvin Historie TGF-b nM.B. Sporn (1983) prokázal in vivo schopnost TGF-b podporovat tvorbu kolagenu a vaskularizaci normální tkáně během hojení Science. 1983 Mar 18;219(4590):1329-31. Polypeptide transforming growth factors isolated from bovine sources and used for wound healing in vivo. Sporn MB, Roberts AB, Shull JH, Smith JM, Ward JM, Sodek J. Historie TGF-b nRik Derynck et al. (1985) naklonovali TGF-b [USEMAP] Historie TGF-b nKathleen Flanders et al. (1988) vyvinula protilátky proti specifickým epitopům TGF-b a tím umožnil studium exprese in vivo Historie TGF-b nJoan Massagué (1985) detailněji charakterizoval receptory pro TGF-b Historie TGF-b nV letech 1992 a 1993 byly naklonovány receptory pro TGF-b Historie TGF-b nObjev intracelulárních přenašečů signálu TGF-b - v roce 1995 na Drosophila melanogaster a v roce 1996 na Caenorhabditis elegans. [USEMAP] Historie TGF-b n Jeffrey Wrana, Lilana Attisano a Joan Massagué (1994) – popis aktivace receptoru Historie TGF-b n Mad (mothers against decapentaplegic) + Sma = SMAD Transforming growth factor-b nZástupci rodiny a jejich nejvýznamnější funkce n TGF-b rodina n více než 60 proteinů –Transformující růstové faktory – b (TGF-b) –Activin(y) –Bone Morphogenetic Proteins (BMP); Growth/Differentiation Factors (GDF) TGF-b rodina Genes to Cells (2002) 7, 1191-1204 TGF-b rodina n Bone Morphogenetic Proteins (BMP) –klíčové faktory pro vývoj kostí a chrupavek, ale i další funkce. – BMP Funkce Genový lokus BMP1 Nenáleží do TGF-b rodiny. Metaloproteinása. 8p21 BMP2 Indukuje vývoj kostí a chrupavek; klíčový regulátor diferenciace osteoblastů. 20p12 BMP3 Indukuje tvorbu kostí. 14p22 BMP4 Reguluje tvorbu zubů, končetin a kostí z mesodermu; ovlivňuje hojení zlomenin. 14q22-q23 BMP5 Úloha při tvorbě chrupavek. 6p12.1 BMP6 Důležitý pro funkci kloubů. 6p12.1 BMP7 Klíčový faktor diferenciace osteoblastů a vývoje ledvin. 20q13 BMP8a Reguluje vývoj kostí a chrupavek. 1p35-p32 BMP8b Exprimován v hipokampu. 1p35-p32 BMP10 ? Vývoj srdce. 2p14 BMP15 ?Vývoj oocytů a folykulů. Xp11.2 Chen, Di, Zhao, Ming, and Mundy, Gregory R. (2004). "Bone Morphogenetic Proteins". Growth Factors 22 (4): 233–241 TGF-b rodina n Growth/Differentiation Factors (GDF) –faktory podobné BMP GDF Funkce Genový lokus GDF1 Regulátor vývoje levo-pravé asymetrie během embryogeneze. 19p12 GDF2 Indukuje cholinergní fenotyp. Chr.10 GDF3 ? 12p13.1 GDF5 Důležitý pro vývoj kostí a kloubů. 20q11.2 GDF6 Důležitý pro vývoj kostí a kloubů. Chr. 8 GDF7 Důležitý pro vývoj kostí a kloubů. Chr. 2 GDF8 Myostatin; regulátor funkce kosterního svalstva. Negativní regulátor svalového růstu. 2q32.2 GDF9 Exprese v oocytech během folikulogeneze. Chr. 5 GDF10 BMP3b; kontroluje endochondrální osifikaci Chr. 28 GDF11 Důležitý při vývoji pátěře. 12q13.13 GDF15 Vysoká exprese v placentě; indukovaný NSAIDs; inhibitor karcinogeneze; induktor apoptózy ? 19p13.2-p13.1 TGF-b rodina n Activin(y) –dimerické proteiny regulující syntézu a sekreci FSH a regulující menstruační cyklus, ale také imunitní a nervový systém; důležité faktory při tvorbě kůže a hojení ran; – –dimer obsahuje dvě identické b podjednotky a dvě b podjednotky inhibin(u) (A nebo B); – –Activin A (bAbA); –Activin B (bBbB); –Activin AB (bAbB). – nInhibin(y) –Inhibuje produkci FSH; –dimer a a b podjednotky – (A nebo B) – – Sulyok, S., Wankell, M., Alzheimer, C., and Werner, S. Activin: an important regulator of wound repair, fibrosis, and neuroprotection. Mol. Cell. Endocrinol., 225: 127-132, 2004. [USEMAP] TGF-b rodina n Transformující růstové faktory – b – důležité faktory řídící embryogenezi, diferenciaci, tkáňovou regeneraci, ale i rozvoj řady onemocnění – –TGF-b1 (Chr. 19) –TGF-b2 (Chr. 1) –TGF-b3 (Chr. 14) – –76-80% homologie – [USEMAP] Transforming growth factor-b nSyntéza, produkce a aktivace n Syntéza a sekrece TGF-b nSyntetizován a sekretován v podobě latentního komplexu nasociovaný s Latency Associated Peptide (LAP) = small latent complex; nLAP dimer spolu s TGF-b dimerem je kovalentně vázán na Latent TGF-b Binding Protein (LTBP) = large latent complex Syntéza a sekrece TGF-b Syntéza a sekrece TGF-b Syntéza a sekrece a aktivace TGF-b Aktivace TGF-b nFyzikálně-chemicky –v kyselém mikroprostředí buněk –extrémními změnami pH – g zářením –reaktivními skupinami kyslíku –zvýšenou teplotou – nEnzymaticky a prostřednictvím nespecifických proteinových interakcí –Proteázy •Plasmin, Catepsin G •Calpain –MMP-9 a MMP-2 –Glykosidázy –Interakce s trombospondinem –Interakce s integrinem avb6 – • – Transforming growth factor-b nPřenos signálu a jeho regulace –receptory –sekundární přenašeči –„alternativní“ dráhy –regulace genové exprese Přenos signálu TGF-b Massague J. Nat. Rev. Mol. Biol. 2000 Transforming growth factor-b nPřenos signálu a jeho regulace –receptory –sekundární přenašeči –„alternativní“ dráhy –regulace genové exprese Receptory TGF-b rodiny Accesory Receptors – Type III: betaglycan, endoglin Massague J. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91 Receptory TGF-b rodiny R-SMAD Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2005. 21: 659-93 SMAD Massague J. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91 Transforming growth factor-b nPřenos signálu a jeho regulace –receptory –sekundární přenašeči –„alternativní“ dráhy –regulace genové exprese Přenos signálu nezávislý na SMAD Nature 425 (2003) 577-584 Massague J. Nat. Rev. Mol. Biol. 2000 Regulace transkripce Nature 425 (2003) 577-584 Kofaktory Massague J. Nat. Rev. Mol. Biol. 2000 Inhibice proliferace u epiteliálních buněk Carcinogenesis vol.27 no.11 pp.2148–2156, 2006 Shrnutí přednášky nTGF-b rodina zahrnuje řadu multifunkčních proteinů. nPřenos signálu je intracelulárně přenášen SMAD proteiny, ale interaguje s řadou dalších signálních drah. nPůsobení TGF-b je závislé na buněčném typu a také přítomnosti dalších faktorů. n Na konci dnešní přednášky by jste měli: 1. 1. rozumět základním principům přenosu signálu 2.znát základní zástupce a funkce proteinů TGF-b rodiny; 3.umět popsat přenos signálu který závisí na SMAD;