Podstata přenosu signálů A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno • Představuje zákonitě koordinovanou souslednost reakcí (odvíjející se od specifické chemické struktury, podstatou je změna konformace) vedoucích od vnější plasmatické membrány (návázání regulátoru na tuto membránu anebo průchod regulátoru touto membránou) přes cytosol k jádru (expresi genetické informace). • Tohoto procesu se účastní řada regulátorů různé chemické povahy. • Výsledkem je zapezpečení všech fyziologických funkcí buněk a organismu včetně regulace cytokinetiky. • Jeden z principiálních rozdílů spočívá zejména v tom, zda má daný regulátor povahu hydrofilní (lipofóbní) anebo Hydrofóbní (lipofilní) Transdukce (přenos) signálů 2 Některé energie důležité pro buňky 3 Nekovalentní pevné interakce mezi dvěma makromolekulami s komplementárními povrchy • Nejjednodušší způsob reakce • Může však spolupůsobit celá škála chemických vazeb silné i slabé povahy a jejich kombinace 4 Četné molekuly se štěpí, vstoupí-li do jejich struktury molekula vody při hydrolýze. Jako příklad uvádíme hydrolýzu bílkoviny, kdy mezi atom dusíku (zelený) a uhlíku s vázaným kyslíkem vstoupí molekula vody. Vzniká tak aminoskupina a karboxyl. Chemicky takovou reakci zaznamenáváme: -NH-CO- + H2O = -NH2 + -COOH Samovolná reakce by probíhala velmi pomalu. Katalyzátor ji urychluje působením na elektronové oblaky (oranžová). Elektrony se vzájemně odpuzují, zatímco kladně nabité atomy (protony) je přitahují. Šipky naznačují, jak katalyzátor svými dvěma funkčními skupinami vyvolá pohyb elektronů, čímž se oslabí vazby mezi atomem dusíku a uhlíku, takže se přeruší. Vlastní tělo katalyzátoru udržuje funkční skupiny v přesné poloze, nezbytné k vyvolání naznačených změn v elektronových oblacích štěpené vazby. „Umí“ však i leccos jiného, zejména „připoutat“ látku, která má být štěpena. 5 Stavy A a C se od sebe liší obsahem energie, který se může uvolnit jako volná energie Ev. Přesto přeměna A–C neproběhne samovolně. Musí projít stavem B, který má vyšší obsah energie než A. Aby se mohla uvolnit volná energie Ev, musíme stavu A „půjčit“ energii Ea; jen tak se dostane na mezistupeň B. Chemické reakce, syntézy a štěpení, nahodilost a zákonitost dějů 6 Substrát přesně zapadne do lůžka v molekule enzymu. V tomto lůžku ho poutají různé typy sil: hydrofobní (modrá), přitahování opačně nabitých skupin (zelená v substrátu a červená v lůžku), vodíkové můstky. Štěpená vazba se tím dostane mezi „nůžky“ silně polárních skupin (např. karboxylů). Při „vyvolaném přizpůsobení“ je enzym teprve domodelován silami, které poutají substrát k jeho lůžku. Jak vzniká komplex substrát – enzym 7 Alosterická aktivace enzymu. Enzym sám není schopen rozštěpit substrát, neboť jeho molekula nemá správný tvar. Teprve naváže-li se na jiné místo regulační molekula (hnědá zprava), získá funkční formu. regulační molekula substrát enzym 8 Regulační molekula se připojuje opět na jiném místě molekuly enzymu, než kam se váže substrát. Tím se liší od pouhého blokování lůžka, které může způsobit látka podobná substrátu (soutěživá čili kompetitivní inhibice). Alosterická inaktivace patří k regulačním pochodům. Může ji vyvolat jen zcela určitá látka, ta, která svými vlastnostmi přesně odpovídá místu, na které se váže. enzym Regulační molekula Alosterická inaktivace enzymu. 9 P. Cohen: TIBS, 17 (10), 408–413, 1992 Pět základních signálních systémů, které fungují v eukaryotických buňkách 10 11 Pět mezibuněčných paralelních signálních drah aktivovaných receptory svázanými s G-proteiny, tyrozin kinázovými receptory nebo oběma typy HLAVNÍ ROZDÍL V PŮSOBENÍ MEZI REGULÁTORY HYDROFILNÍ (LIPOFÓBNÍ) A HYDROFÓBNÍ (LIPOFILNÍ) POVAHY 12 Struktura membrány může však obsahovat některé funkční prvky, třeba kanálek (dole) s hydrofilním vnitřkem. Kanálek může měnit svůj rozměr, a tím regulovat průchodnost látek. Většinou však v roli regulátorů vystupují membránové bílkoviny. Jak procházejí látky membránami? Polární látky (například ionty) jsou ve vodě obvykle obklopeny několika molekulami vody (hydratovány). To znemožňuje jejich průchod hydrofobní mezivrstvou v membráně. Když se však obalí hydrofobním pláštěm, snadno přes membránu projdou. 13 receptory růstové signály hydrofilní povahy (proteiny, katecholaminy, apod. molekuly signálové transdukce molekuly zesilovací kaskády regulátory transkripce cykliny CDKs p27 p21 p16 p15 Lipofilní regulátory 14 PŘÍKLADY Změna konformace na úrovni membrán a cytosolu 15 PLA2: fosfolipáza A2, 5-LOX: 5-lipoxygenáza, 5HETE: 5 hydroxykyselina, LTA4, C4: leukotrien A4, C4, PKC: protein kináza C, DAG: diacylglycerol, PIP2: fosfoinositoldifosfát, PLC: fosfolipáza C, Tyr K: tyrosin kináza Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ AA 5HETE LTC4LTA4 PIP2DAG Tyr-K Tyr-K PLA2 5-LOX PKC PLC + Nuclear responses EGF EGF 16 Přenos signálu přes receptor pro epidermální růstový faktor (EGF) se zapojením drah metabolismu kyseliny arachidonové (AA) Kaskáda proteinových kináz v přenosu signálu Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ ATPase PIP2 DAG Ca 2+ PLC RSRS G C K sm ACTIVATION OF CELLULAR TARGET PROCESSES protein phosphorylation kinase kinase kinase kinasekinasekinasekinase 17 A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993 18 Struktura izoforem protein kinázy C (PKC) A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993 19 Model aktivace protein kinázy C Figure 3–65. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. 20 Evoluční strom vybraných proteinových kináz A. Kyselina fosforečná/ortofosforečná B. Kyselina pyrofosforečná C. Kyselina trifosforečná Tyto kyseliny jsou nejdůležitějšími sloučeninami v přeměnách a úschově energie v živých systémech. 21 Vznik a činnost cAMP. V membráně buňky je bílkovina, která má dvě funkce: na vnější straně membrány je specifickým receptorem (přijímačem) signální molekuly (hnědá kulička) a na vnitřní straně membrány se po přijetí signálu mění v enzym, který převádí ATP na cAMP a pyrofosfát. Legenda: hnědá kulička – signální molekula žlutá – adenylátcykláza modrá – alosterická bílkovina tyrkysová – aktivní enzym Oranžová – inhibitor cAMP 1, 2, – dva způsoby aktivace Pomocí cAMP 22 („kofaktor“) Jeden z hlavních významů popsaných reakcí – značný stupeň zesílení Stupně zesílení: • Každá adenylátcykláza vyrobí mnoho molekul cAMP • Každá molekula cAMP aktivuje jednu proteinkinázu, ta má za úkol především připojit kyselinu fosforečnou na enzym syntetizující glykogen z glukózy, a tím jeji vyřadit z provozu. Tak zablokuje mnoho molekul enzymu • Současně naváže kyselinu fosforečnou na kinázu enzymu rozkládajícího glykogen. Tím uvede v činnost mnoho molekul kinázy. • Jedna molekula kinázy však aktivuje mnoho molekul enzymu rozkládajícího glykogen. Kdyby každé zesílení bylo jen desetinásobné, pak výsledkem je 10 000 násobné zesílení rozkladu, podpořené zablokováním syntézy. 23 INHIBICE B. DĚLENÍ Změna konformace jako podstata řízení cytokinetiky 24 Science 262, 1644, 1993 STIMULACE B. DĚLENÍ Změna konformace jako podstata řízení cytokinetiky 26 R. A. Laskey et al.: Science 246, 609, 1989 27 Schema eukaryotické replikační vidličky ukazující sehrané působení DNA polymeráz a a d na opačných stranách vidličky J. O. Funk and D. A. Galloway: TIBS, 23, 337–341, 1998 28 Model blokace inhibice komplexů cyklin dependentní kináza – cyklin prostřednictvím p21 PŘÍKLADY Změna konformace na úrovni genomu 29 Negenotoxické hepatokarcinomy (nádorové promotory, hormony, TCDD) Negativní mutagenicita (Nereagují s DNA) Nízká dávka Vysoká dávka Inhibice oxidativního stresu Indukce reparace DNA Inhibice proliferace v oblastech GST-P+ ohnisek Suprese apoptózy Protekce GJIC Aktivace detoxifikačních systémů v játrech (CYP2C11, P-450 NADPH oxidoreduktáza) Buněčná signalizace (GABA, MAP kinázy) GST-P: glutathion S-transferáza placentární forma Indukce oxidativního stresu (P-450, ROS, 8-OHdG) Indukce reparace DNA Zvýšení proliferace v oblastech GST-P+ ohnisek Indukce apoptózy Inhibice GJIC Inhibice CYP2C11 Hormetický efekt na karcinogenezi (Inhibice GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) Promoce karcinogeneze (Indukce GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) Přesné prahování karcinogenicity Fukushima et al., Carcinogenesis, 2005 30 31 Aktivace NF-kB TNF-a Superodina jaderných receptorů 32 PODSTATA – ZMĚNA KONFORMACE 33 34 Tři třídy buněčných povrchových receptorů 35 Tvorba vazebných míst inositol fospholipidu PI 3-kinázou 36 Tvorba signálních proteinů s PH doménami k plasma tické membráně během aktivace B buněk 37 Jedna z cest podpory buněčného přežití přes PI 3-kinázu Některé signální proteiny fungující přes cytokinové receptory a signální dráhu Jak-STAT 38 39 Jak-STAT signální dráha aktivovaná a-interferonem Model Smad-dependentní signální dráhy aktivované TGF-b 40 Proteinové kinázy a fosfatázy 41 Lipidomics reveals membrane lipid remodelling and release of potential lipid mediators during early stress responses in a murine melanoma cell line Gábor Balogh a, Mária Péter a, Gerhard Liebisch b, Ibolya Horváth a, Zsolt Török a, Enikő Nagy a, Andriy Maslyanko a, Sándor Benkő c, Gerd Schmitz b, John L. Harwood d,⁎, László Vígh a,⁎Biochimica et Biophysica Acta xxx (2010) xxx–xxx Přehled možných drah uvolnění kyseliny arachidonové (AA), použitývh inhibitorů a detekovaných lipidových meziproduktů (podtrženo) Kontrola transkripce genů environmentálními signály 43 44 Fosforylace proteinů 45 3-D struktura proteinové kinázy 46 Cdk protein funguje jako nástroj integrace 47 Aktivace protein kinázy typu Src dvěma následujícími ději 48 Protein kináza typu Src funguje jako nástroj integrace GTP-vazebné proteiny jako molekulární spouštěče 49 Srovnání dvou hlavních vnitrobuněčných signálních mechanismů u eukaryotických buněk 50 Velké konformačmí změny v EF-Tu způsobené hydrolýzou GTP 51 52 Alosterický “walking” protein Transport vápníkových iontů pumpou Ca2+ 53 Receptorem zprostředkovaná dráha aktivace 54 informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. potenciál informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. Plýtvání Lenost Nižší efektivita Nižší efektivita Vysoká efektivita (Lenost) Lepší var. 55 56