Lipidové komponenty význam pro zachování homeostázy, zdraví a regeneraci organismu: (Možnosti modulace II) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno VÝZNAM A NĚKTERÉ MOŽNOSTI MODULACE IPIDOVÉHO METABOLISMU Důsledky změněného potravního režimu O o g o < CD VYBRANÉ VYSLED tfí c o-o-c 3 CD< O 3 á POTRAVA: Základní podmínka existece, (zdroj živin, základ veškerých regulací) Mnoestv Časové i Krysy: Střídání 24 h hladovění a následné realimentace Interní i tentní krmení (Pokusy z 50.-60. let 20.stol.) Změny regulace CNS, aktivace nespecifických mechanismů adaptace {osy hypofyza-n Ml ledvinka) Zvýšená nesarpec tuků a glycidú a) Zvýšená růstová a migračn aktivita explantováných tkání in vitrn b) Zvýšená re popu lačni aktivita buněk obnovných krvetvorných populací u adaptovaných zvířat {in vivo) Důsledky modulace pomocí potravního režimu je nutriční model spočívající ve změně frekvence příjmu potravy. Významně moduluje metabolismus všech živin (zejména však metab. energetický a lipidový) Současně významně moduluje růstové vlastnosti tkání Vyšil bazalm metabolismus adaptovaného zvířete Niisi Mikovy metabolismus adaptovaného zvířete IF ? íoooo r Důsledek střídání 24 h hladovění a následné realimentace 1 2 4 6 8 12 16 20 28 32 Týdny adaptace Upraveno podle: Petrásek R. et al., 1970 Dobový kontext od 40.- 80. léta 20. stol. Radiobilogicky výzkum především pro vojenské účely. Důsledky: Utlumení a poškození krvetvorby (intenzívně proliferujících populací) imunitních funkcí a celého organismu. Vznik nádorů včetně leukémií atd. ,smrt. (Nevada, USA) ^ Jestliže dojde k celotělovému vystavení ionizujícímu záření, dochází k rozvoji tzv. RADIAČNÍHO SYNDROMU provázeného devastujícími účinky na organismus 1 Form) nemoc i z ozái sení (myš) _ | Průběh nemoci závisí zejména na 1) dávce ozáření 2) na druhu a celkové „kondici" organismu. Forma nemoci z ozáření Dávka Hlavní oblasti postižení Dřeňová (má smysl 1) 0.1- 6 Gy Kmenové buňky K.D. Epitely, zejména střeva viz výše včetně C.N.S. (do J Uli Sví zv&ünuü této řonuv mzhoúulá o Dřažíří o/siíijjtenjy PozL. 1) výsledky uplatnitelné v radioterapii nádorů 2) objev kmenové buňky krvetvorby 3) radiací utlumená krvetvorba - model pro studium reg. schopností savčího org. Další východiska vztahující se k problematice Prof. Milan Pospíšil - oddělení itivity BF vější náhodná pozorování in vivo ukázaly, že: zvířata se spontánně vyšší kapacitou lipogeneze ( a aktivovaným energetickým metabolismem '— se vyznačují celkově vyšší radiosenzitivitou !!!!!!!!!! (RQ >1) Otázky: Do jaké míry a jakým způsobem může určitá metabolická orientace jedince ovlivnit celkovou zdatnost a odolnost vůči pronikavé radiaci ? ak lze tyto vtahy detailněji studovat, metodicky podchytit ? odné metodické propojení) : podrobnější vymezení vztahů mezi specifickou metabolickou orientací a chováním obnovných buněčných populací Vlastní výsledky u myší neozářené ozářené Kozubík A., et al.: Gen. Physiol. Biophys. 7, 293-302, 1988 IF x Model r. utlumené hemopoézy: Detailnější vymezení vztahů RQ >1 upraveno podle: Petrásek R. et al., 1970 Prežívam C a IF myší po ozarení (3 kmeny) C 57 BL/ 10 í 8.7 Gy 100 • 50- >S O *** lymf. §j metastáza iq SW-620 ř> ~ Kovaříková M. et al. Eur J Cancer 2000 Hofmanova J. et a. Eur J Nutr 2005 Kovaříková M. et al. Differentiation 2004 Hofmanová J. et al. Cancer Letters 2005 Hýžďalová M. et al. Cytokine 2008 Vacu|ová A. et a|. Cancer l_etters 2005 Hofmanová J. et al. Mol Nutr Food Res 2009 PUFAs (AA, DHA) zvyšují citlivost nádorových buněk kolonu k apoptóze indukované butyrátem nebo cytokiny rodiny TNF Shrnutí a závěry (teoreticko praktické dopady) Lipidy patří spolu s proteiny a sacharidy mezi hlavní složky výživy. Důležité je nejen jejich množství a kvalita těchto živin, ale také časové rozložení jejich příjmu. Lipidy jsou nejen významným zdrojem energie, ale představují i jedny z hlavních stavebních kamenů buněk. Kromě strukturní úlohy (jako složky membránových fosfolipidů) je neméně podstatná řada jejich funkčních vlastností. Změny spektra mastných kyselin (MK/VNMK) v membránových strukturách mají dopad nejen na fyzikálně-chemické vlastnosti (fluiditu, konformaci apod.), ale zejména na interakce receptoru s jejich ligandy. MK/VNMK tak hrají důležitou úlohu v přenosu signálů a fungují jako intra- i intercelulární mediátorv a modulátory b. signalizační sítě. Proto patří mezi významné faktory schopné ovlivnit jak dělení a zánik normálních, ale i transformovaných buněčných populací, tak proces maligní transformace. Hlavní mechanismy působení PUFA v buněčných signalizacích 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cytokinetiky 2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových faktorů, cytokinů a imunitní systém 3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS) vznikaj peroxidací lipidů. Významným faktorem je množství lipidů v potravě. Vysoké koncentrace VNMK (anebo přílišná aktivace lipidového/fosfolipidového Metabolismu) mohou nepříznivě ovlivnit buněčné funkce. Tyto negativní účinky VNMK lze účinně inhibovat (např. NSAIDs) a tak napomáhat navrátit deregulovaný systém k homeostáze.l^^B UPLATNĚNI ek lipidové povahy v kontextu lál regulace cytokinetiky (proliferace, diferenciace a apoptózy) kontextu jejich interakcí s vybranými farmak Cisplatin (c/5-diamminedichloroplatinum(II), cis-DDP) > one of the most effective and potent anticancer drugs; > displaying clinical activity against a wide variety of epithelial malignanciesisuch as lung, head-and-neck, bladder cancer, and most notably in the treatment ofl testicularland ovarianlcancer. 1) serious (adverse reactions), including renal and gastrointestinal toxicity, peripheral neuropathy, etc; 2) both and of cells to the drug limit its application. Biologické „cíle" cisplatiny (adukty s DNA) Novel Concepts in the Development of Platinum Antitumor Drags Curr. Metl. Citem. - Anti-Cancer Agents, 2002, Vol, 2, No. 4 3 Typy DNA aduktů H3NX ^NH3 Intra- (80-90%) "A NH -G^A-C H3Nx yNH3 •t -C' X -G—X—G— -c—x—c— a frekvence j :;jejich výskytu H3N—Fjt—L L = Cl\ HjO.S-R G" ■c- -x- -Y- Inter- l*1 ™j nnanofunctionsl G-adducl mono- Fig. (2). Types of cisplotin-DNA odducts and their frequency of formation. Fuertes, MA et al. Adamantylaminové Pt(II) a Pt(IV) komplexy Dvojmocné Pt(II) (reaktivní s DNA) LA-9 Cisplatina (II) Syntetizované F. Žákem a spol., PLIVA - Lachema Zak et al., 2004, J Med Chem, HaN ,CI HjJN Cl nl™Nnl''w H,N Cl LA'5 382 s/mol H,IVL ^Cl HjW Cl L.\i J44,l2g.tttCtl H;N Cl LA-li *5<,J2 írrtiol redukce OCOCHj HaN^^CI HjN^ | ^Cl LnlZ 554,35 g/mol Výhoda: lipofilní čtyřmocné Pt(IV) . (s DNA nereaktivní) H3N^ Cl H,N I Cl 1 OCOCH, LA-I ÍOJI Jí ^mel OCOCH, H3N' Cl "a OCOCH- 462,21 g/iwof OCOCH, H,N,J „Cl H2N a OCOCH, CK CH3 La-15 582,7« gAttet LA-12 JM-216 (1. z řady v klinickém zkoušení) cisplatin LA-12 (IV) | reactivity t Hydrophobicity (capacity factor HPLC) flflflflflflflflflflflflflfli iuuuuuuuuuuuuu' (FAAS) (19.5x in A2780; 29.3* in A2780cis) special type of a large reparable by Nuclear Eexcision Repair System 1 DNA LA-12 ttt Replication inhibition Transcription inhibition Cell-cycle arrest DNA repair Cell death Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů LA-12 ? Onc^ene {2003) 22, 7265-7279 U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze) Přispívají k tomu změny v regulaci proteinů r. Bcl, Fas, Survivinu, Glutathionu Figuro 6 Disruption of p53-dependenl apoplotic pathway in cisplalin-resistanl tumor cells Oncogene „Dose-response" křivky (mtt test) Nejcitlivější k cis-DDP z panelu senzitivních ovariálních buněk (H134, IGROV-1, OVCAR-3),s najnižším % apoptózy (6-14%) (Kolfschoten, G.M. et al., Gyn. Oncol., 2002) Získaná rezistence udržovaná přídavkem cisplatiny do kultivačního média (výsl. konc. 1 uM, každá 2. pasáž) A2780 A2780CÍS 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 100 1000 Concentration [iM] Faktor rezistence (18:6) = 3 Concentration [uM] Fig. 2. Time- and close-response effects on the survival of A2780 and A278Gcis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 \jM and 256 (xM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC9o) arc displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. Kozubik et al., 2005,|Biochem Pharmacol Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus A2780 (single staining) A2780 untreated control qo/g 1:43.5 ±2.5% s: 39.2 i 6.0 % g27m: 17.3 ±5.5% 24 hr cisplajin<50) GO'gY 21.5 ±4.1 %(*) s: 35Á+ 4.3 % g2-■ G0/G1: 51.1 i 4.4% S: 33.5 ± 1.9 % G2/M: 154 ±2.9% G0/G1: 66.3 £ 5.1 % S 23 34 t 3.2 % G2/M: 10.4+2.7% CISPLATIN(50) G0.G1: 17.9 ± S.8 % (*) S: 66.01 4.9 % (*) G2M: 20.7 ± 6.9 % G0/G1: 184 +10.0 %(*) S: 47.0 ± 16.7% G2/M: 34.6+ 12.4% (x) GOG1: 43.9 ±5.0% (*) S: 34.1 ± 5.0 % G2;M:21.9±2.5%(x) LA-12(50) G0/G1: 29.2 ± S.9 % (*) S: 53.7 + 2.6 % (*#) G2/M: 19.8 ±0.8% G0/G1: 24.3 ± 6.3 %(*) S: 41.1 - 8.1 % G2/M: 34.6 1 3.2 % (x) G0/G1: 39.9 ±3.1 % (*) S: 37.0 ± 11.3 % (*) G2/M: 27.5 ± 7.7 % (x) Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol Závěr: účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus se liší dynamikou a jsou u ovariárních nádorových linií lišících se rezistencí rozdílné. - Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu); - p21, Gadd45a („p53 target genes" - regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a („DNA repair"); - Mdm2 (regulace stability p53) Cdk1 cyclin B Cdklcyclín A Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklin A, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny 6 h 12 h 24 h A2780 A2780cis A2780 A2780cis A2780 A2780cis cyclin A --—--- ------ ------ Fold increase í.o o.y u.y ío 1.2 1.1 1.0 1.1 10 1.0 1.1 1.2 1.0 1.2 1.1 1.0 1.3 1.1 cdk2 ------ Fold increase 1.0 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1 1.0 1.0 0.8 1.0 1.2 1.1 1.0 1.0 1.0 1.0 1.2 0.8 cyclin B1 Fold increase 1.0 0.9 0.8 1.0 0.9 0.9 1.0 1.1 1.1 1.0 1.1 1.2 1.0 1.3 1.3 1.0 1.4 1.2 P-actin ____ Nebyly pozorovány žádné změny a A2780cis Equitoxické koncentrace cis-DDP indukují vyšší expresi proteinu p53 (teoreticky vyšší poškození DNA, než po apl. LA-12 a tudíž by cis-DDP měla působit efektivněji), Nebylo tomu tak, tzn. že by musí existovat jiné. např. s poškozením DNA nesouvisející mechanismy působení LA-12 !!!!!! A2780 A2780cis (a) PARP 24 li p53 1 o 5 ř o :> 0 | [5 > r 2 :> 24 h 1 i. l± 0.8* 4.6* 1.4» 1.6± «.1 0.8" 24h 1 (i i± 1.1* 8.2* 1.0* 2.5* [1.2" 2.8* o.l>:; 48 h 1 4 l± 1.4 6.8* 1.8* 2.6* 0.2 4.8* 1.9* 48h 1 6.8* 1.9« 0.2* 3.2* (I. 5" 3.4* 0.6" 72h 1 0.6* 3.7* 0.7* 1.6± 0.2 2.5* 0.6* 72h I 5.61 2.0* 7.0* 2.8« i).8 3.3* 1.0 (d) p-actin 42kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis cells (right panel). The cells u ere not exposed I untreated controls) or exposed to 1CS(, or lCm concentrations of cisplalin or LA- 12 and harvested at 24 h.4X h. and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (p < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between eqnitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) (3-actin (bottom panel). Detekce se zás spojovaných optózou po Analýzy potvrzující dv r v ■ v w u é ■ nvejsi data u b. A2780 v časnějších int. u buněk A2780 Tyto naše výsledky, i když plně nevysvětlují působení cisplatiny a LA-12, se zařazují mezi ty přístupy, které výzkum platinových cytostatik posouvají do nových oblastí. ^^^^^^^^^^H mohou reagovat s dalšími buněčnými strukturami (komponenty) jako jsou např: RNA, proteiny, cytoskeletální filamenta, thioly- obsahující molekuly membranové fosfolipidy. Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk Předpoklad: Vzhledem ke své lipofilicitě, lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být spojeny s interakcemi této látky se složkami buněčných membrán (nebo by mohly být modulovány) ovlivněním membranového složeni. LA-12 indukuje „upregulaci" proteinů DR5, mRNA a zvyšuje zastoupení DR5 v lipidových raftech Zastoupení DR5 a DR4 v membránách HCT 116 Celkové zastoupení DR5 (rafty) DR5 mRNA i i; 10 -g s 2 cisplatin LA-12 a control b cisplatin C LA-12 • Lokalizace DR5 v lipidových raftech Naše další předběžné výsledky naznačovaly (provedené na umělých lipozomálnich strukturách využitím kalorimetrie) že zatímco ani cisDDP ani LA-12 samy o sobě nemění vlastnosti přidání AA významně mění charakter termogramu^^^^^^^B ve smyslu zvýšení membránové fluidity. ce AA s cis-DDP anebo s LA-12 naznačily tendence k fázové separaci (změny nebo objevení se druhého píku). Tyto píky se po kombinaci AA s cis-DDP vs. AA s LA-1 DPPC 1 UM DPPC + LA12 DPPC 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 TEMPERATURE (oC) Vliv CP na DPPC multilamelární lipozómy 30 35 40 45 TEMPERATURE (oC) Vpliy la 12 na DPPC Rozdíly CP vs LA-12 1111111111111111111 (DPPC + 100 jlM AA) + CP Ll 25 (DPPC + 100 jlM AA) + LA12 35 40 45 TEMPERATURE ("C) 35 40 TEMPERATURE (°C) I i i i i I i i i i I DPPC + AA I I I I I I I I I I I I I l DPPC + DHA i 30 35 40 45 50 TEMPERATURE ("C) Vliv AA Po 50|iM AA pozorujeme snížení píku odpovídajcího předpřechodu a zároveň rozšiřování hlavního fázového přechodu - zvýšení fluidity??? přičemž se entalpie přechodu nemění. 30 35 40 45 TEMPERATURE (°C) Vliv DHA je zřejmé, že tendence změny je podobná jako po AA. (DPPC + 100 JlM DHA) + LA 12 25 30 35 40 45 50 TEMPERATURE ("C) DPPC + CP I O < < < < ■J b o < X 5 w X 5 X 5 w X 1 JlM 'JI -I '■J X m I—I O X W Ji 'Ji -I 'J X -i in u w 10 UM 10 lM 50 UM 50 UM 25 50 50 e 1 < ■j I O 3 < 3 71 71 2) U O w 10 UM LA12 50 UM LA12 30 50 25 30 45 50 Conclusions: > In two ovarian cancer cell lines, differing in cisplatin sensitivity resistance to cisplatin,, >we observed a different type and dynamics of cell cycle modulations after cisplatin vs. LA-12 treatment. Although cisplatin is a markedly more potent activator of p53 and should be more effective in cell death induction, LA-12 was a significantly more potent cytostatic and cytotoxic agent; > This might be related to a different mechanism of DNA repair adducts (it has been shown that cisplatin-DNA and LA-12-DNA adducts differ from each other), or to different mechanisms of cell cycle regulation, including Gadd45a accumulation and activity of CDKIs, such as p21waf1/cip1; > Our results indicate that also other mechanisms of the effects of LA-12, which are independent on DNA damage, may exist that are related to changes in phospholipid metabolism and cell mebrane chracteristics. In wírolstudies: Žák F., Turánek J., Kroutil A., Sova P., Mistr A., Poulová A., Mikolin P., Žák Z., Kašná A., Záluská D., Neča J., Šindlerová L., Kozubík A.: Platinum(IV) complex with adamantylamine as nonleaving amine group: synthesis, characterization, and in vitro antitumor activity against a panel of cisplatin-resistant cancer cell lines. J. Med. Chem. 2004 Jan 29; 47(3):761-3. Turánek J., Kašná A., Neča J., Kvardová V., Knótigová P., Záluská D., Horváth V., Šindlerová L., Kozubík A., Sova P., Kroutil A., Žák F., Mistr A.: New platinum (IV) complex with adamantylamine ligand as a promissing anticancer drug: ^^H^^^^HH^^H^^^^^^^^H towards A2780/cisR cisplatin-resistant cell line within homologous series of platinum (IV) complexes. Anticancer Drugs. 2004; 15:537-543. Kozubík A., Horváth V., Švihálková-Šindlerová L., Souček K., Hofmanová J., Sova P., Kroutil A., Žák, F., Mistr, A.,Turánek J.: High effectiveness of platinum(IV) complex with adamantylamine in ^^^^^^^^^^^^^^^^H Biochem. Pharmacol. 2005; 69:373-383. Horváth V., Blanářová, O., Švihálková-Šindlerová L., Souček K., Hofmanová J., Sova P., Kroutil A., Kozubík A.,.: Platinum(IV) complex with adamantylamine overcomes intrinsic resistance to cisplatin in ovarian cancer cells. Gynecol. Oncol. 2006; 102:32-40 In vivo studies: Sova P, Mistr A, Kroutil A, Zak F, Pouckova P, Zadinova M.: 2. Anticancer Drugs. 2005;16:653-7. Sova P, Chladek J, Zak F, Mistr A, Kroutil A, Semerad M, Slovak Z.: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^1 of platinum in rats following single and multiple oral doses of LA-12 [(OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylamine)amminedichloroplatinum(IV)]. Int. J. Pharm. 2005;288:123-9. Cermanova J, Chladek J, Soval P, Kroutil A, Semerad M, Berankova Z, Siroky P, Surova I.: Single-dose ^^^^^^^^1 of a novel oral platinum cytostatic drug ([OC-6-43]-bis[acetato][1-adamantylamine]amminedichloroplatinum [IV]) in pigs. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2004; 26:679-85. UPLATNĚNÍ látek lipidové povahy v kontextu regulace cytokinetiky (proliferace, diferenciace a apoptózy) kontextu jejich interakcí s vybranými farmak Jedním z praktických cílů je využít tyto znalosti v rámci přípravy lipidových nutričních preparátů, případně cytostatik. Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA Posílení terapeutických efektů ? EXPERIMENTÁLNÍ „přenos signálů" ÚČINEK OVLIVNĚNÍ membrána-cytosol-jádro PUFAs cisplatina cytostatika nové generace (LA-12) změny fluidity membrán poškození cytoskeletu, oxidativní stres... ■LU < N LU apoptóza buněčný cyklus a proliferace án el lí cí Podstata možných návrhů projektů - prozatím neuzavřeno Fig. 1. Schematic presentation of arachidonic acid metabolism in the context of gastric tumorigenesis. The expression of cyclooxygenase (COX)-2 and microsomal PGE synthase-1 (mPGES-1) is induced by Helicobacter pylori (H. py/on)-associated inflammatory responses. The simultaneous expression of both COX-2 and mPGES-1 leads to induction of the prostaglandin PGE2 pathway, which results in macrophage accumulation. These macrophages are activated by infectious stimuli, resulting in the induction of tumor necrosis factor (TNF)-a-dependent SPEM development and the promotion of Wnt signaling, which may contribute to gastric tumorigenesis. The induction of angiogenesis and activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling are also possible mechanisms of PGE2 in tumorigenesis. COXIBs, COX-2 selective inhibitors; NF-kB, nuclear factor-KB; NSAIDS, nonsteroidal anti-inflammatory drugs; SPEM, spasmolytic polypeptide/TFF2-expressing metaplasia; TLRs, Toll-like receptors. Cancer Sci. 2009 Oct;100(10):1779-85. Epub 2009 Jun 23. Prostaglandin E2, Wnt, and BMP in gastric tumor mouse models. Oshima H, Oguma K, Du YC, Oshima M. Cancer Sei. 2009 Oct;100(10):1779-85. Epub 2009 Jun 23. Prostaglandin E2, Wnt, and BMP in gastric tumor mouse models. Oshima H, Oguma K, Du YC, Oshima M. Fig. 3. Schematic presentation of the canonical Wnt signaling and cyclooxygenase (COX)-2/prostaglandin PGE2 pathway in gastric tumor development. p-Catenin mutations, SFRPs methylation, and downregulation of E-cadherin or p-TrCP can activate Wnt signaling in gastric cancer. Cooperation of the Helicobacter pylori (H. py/or/)-induced COX-2/PGE2 pathway with Wnt activation leads to the development of gastric adenocarcinoma. Without the induction of the PGE2 pathway, Wnt activation alone does not cause gastric cancer development. tmPGES-1, microsomal PGE synthase-1.