Fyziologie buněčných systémů (diferenciace) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno Diferenciace Differences in mRNA expression patterns among different types of human cancer cells Differences in the proteins expressed by two human tissues Polyklonální charakter kostních buněk Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a – kmenová buňka v embryonální podobě b – kmenová buňka v dospělosti a b b Buněčné komponenty hematopoetického mikroprostředí (H.I.M.) v kostní dřeni (podle Knospe 1978) Buněčný typ předpokládaná funkce Endotelie sinusoidů zachycování kmenových buněk, výměna metabolitů uvolňování zralých buněk do cirkulace, část mikroprostředí umožňující buněčnou proliferaci Fibroblasty tvorba kolagenu, mukopolysacharidů, indukce diferenciace? Tukové buňky vyplění prostoru po zaniklé kostní dřeni, proliferace pluripotentních kmenových buněk Retikuloendotelové buňky, monocyty fagocytóza, tvorba CSF a jiných hemokininů indukce diferenciace? Endostální buňky tvorba CSF a jiných hemokininů kmenové buňky stromatu? Kost mechanická ochrana, tvorba hemokininů? Primární imunitní odpověď LYMFOPOÉZA PRIMÁRNÍ L.O. SEKUNDÁRNÍ L.O. (Lymfatické uzliny a slezina) Kostní dřeň Thymus –“thymové hormony“ Sekundární imunitní odpověď Recirkulující paměťové buňky s dlouhou dobou života T- lymfocyty Buněčná imunita Plazmatická buňka B lymfocyty Humorální (IG) imunita Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii 1 CFU-S - BFU-E - CFU-E - CFU-C - CFU-eozinofilů - CFU-Meg - CFU-makrofágů2 - CFU-BL3 - CFU-TL3 erytroblasty - myelocyty - megakaryocyty Přestupdokrve Morfologicky rozpoznatelné buňkyPluripotentní buňky Proliferující buňky Neproliferující buňky 100 % 50 % 0 % Hematopoetickébuňkykostnídřeně Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. 1Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3nejsou odvozeny od CFU-S. Progenitorové erytroidní kmenové bunky BFU-E Zvýšená proliferace za erytro- poetického stresu CFU-E EP stimulace Obr. 23. Na obrázku je znázorněna zvýšená proliferace při erytropoetickém stresu, která může vést k značné expanzi kompartmentu progenitorových erytroidních kmenových buněk. Citlivost k erytropoetinu (EP) se objevuje až v pozdějších stádiích. Upraveno podle Schofielda a Lajthy (1977). Citlivost na erytropoetin BFU-E CFU-C Obr.27. Model humorálního řízení hemopoézy. Nejnezralejší buňky obsahují receptory k faktorům nezávislým na diferenciaci jednotlivých řad, jako je IL3. Při maturaci se postupně tyto receptory ztrácejí a objevují se specifické receptory pro humorální faktory jednotlivých řad [pro erytropoetin ( ) a pro CSF ( ) ]. Podle Iscova (1978) Kmenová buňka citlivé na erytropoetin citlivé na CSF citlivé na IL3 CFU-E Polyklonální charakter kostních buněk Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a – kmenová buňka v embryonální podobě b – kmenová buňka v dospělosti a b b Attractor „cílový“ pohyb Limita je matematická konstrukce, vyjadřující, že se hodnoty zadané posloupnosti nebo funkce blíží libovolně blízko k nějakému bodu. Právě tento bod je pak označován jako limita. Trajektorie souvislá čára, kterou hmotný bod při svém pohybu opisuje, se nazývá trajektorie hmotného bodu. Attractor „cílový“ pohyb Některé pojmy Atraktory - vizualizace Jedním způsobem vizualizace chaotického pohybu, nebo opravdu libovolného typu pohybu, je vytvoření fázového diagramu pohybu. Jiný příklad někdo kreslí pozici kyvadla vůči jeho rychlosti. Kyvadlo v klidu bude zobrazeno jako bod a kyvadlo v periodickém pohybu bude nakresleno jako jednoduchá uzavřená křivka. Když takový graf vytváří, uzavřenou křivku, křivka se nazývá orbita. Lorenzův atraktor popisuje pohyb systému ve stavovém prostoru. V matematice a fyzice se teorie chaosu zabývá chováním jistých nelineárních dynamických systémů, které (za jistých podmínek) vykazují jev známý jako deterministický chaos, nejvýznamněji charakterizovaný citlivostí na počáteční podmínky (viz motýlí efekt). Malá změna v počátečních podmínkách vede po čase k velmi odlišnému výsledku. V důsledku této citlivosti se chování těchto fyzikálních systémů, vykazujících chaos, jeví jako náhodné, i když model systému je deterministický v tom smyslu, že je dobře definovaný a neobsahuje žádné náhodné parametry. Příklady takových systémů zahrnují atmosféru, solární systém, tektoniku zemských desek, turbulenci tekutin, ekonomii, vývoj populace. Systémy, které vykazují deterministický chaos, jsou v jistém smyslu složitě uspořádané. Tím je význam slova v matematice a fyzice v jistém nesouladu s obvyklým chápáním slova chaos jako totálního nepořádku. Původ tohoto slova lze najít v řecké mytologii - viz chaos. Chaotický pohyb Abychom mohli klasifikovat chování systému jako chaotické systém vykazovat následující vlastnosti: musí být citlivý na počáteční podmínky musí být topologicky tranzitivní a jeho periodické orbity musí být husté Citlivost k počátečním podmínkám znamená, že dvě blízké trajektorie ve fázovém prostoru se s rostoucím časem rozbíhají (exponenciálně). Systém se chová identicky pouze když jeho počáteční konfigurace je úplně stejná. Již při malých diferencích toto neplatí. Příkladem takové citlivosti je tzv. které ale v průběhu času mohou vést až k tak dramatickým změnám, jako je výskyt tornáda. Mávnutí křídel motýla zde představuje malou změnu počátečních podmínek systému, která ale způsobí řetěz událostí vedoucí k rozsáhlým jevům, jako jsou tornáda. Kdyby motýl nemávl svými křídly, trajektorie systému by mohla být zcela odlišná. 3D model Atraktor většina stavových trajektorií (drah hmotného bodu) se přibližuje a „obmotává“ nějakou obecnou limitu. Systém končí ve stejném pohybu pro všechny počáteční stavy v oblasti okolo tohoto pohybu, téměř jako by byl systém k tomuto pohybu (trajektorii fázového prostoru) přitahován (anglicky 'attracted'). Attractor „cílový“ pohyb 1 attractor (malá miokroheterogenita) 2 oddělené attractory Six steps at which eucaryotic gene expression can be controlled Děje v buněčné diferenciaci growth factors receptor genes early later cell amino acids 18. cytokinesis 10. 9. 8. 2. 1. regulators hnRNA mRNA kinases/2nd messengers nucleus replitase proteins 15. (enzymes) 14. 13. 12. 11. 7. 6. 5. 4. 3. S G2 M17. 16. Growth factor Receptor DNA synthesis Transducer Effector 2nd messenger Target Regulatory proteins RNA/protein synthesis Tyrosine kinase abl erb B2/neu fes/fps fgr fyn kit lck met ret sea src trk yes Nuclear fos jun myb myc ski Serine kinase mil/raf mos pim-1 pks raf rel G protein rab ral ras Receptor bek erb B fkg fms mas ros Growth factor fgf-5 hst sis int-2 MEMBRANECYTOSOLNUCLEUS Receptor Receptor Receptor Receptor Receptor tyrosine kinase G protein PLCg G protein G protein PLA2 Adenylyl- cyclase Na+/H- antiport [pH]i ? cAMP PKA Arachidonate PG TX Calmodulin DG IP3 PKC PK (?) [Ca2+]i Oncogenes According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991 Zhodnocení dat: vymezení významných interakcí pomocí matematické analýzy dat upřesnění modelových exp. podmínek pro detailnější studium mechanismů Vytvoření souboru dat detekcí proliferace, diferenciace a apoptózy u buněk v definovaných časových intervalech Ovlivnění metabolismu eikosanoidů I. dodáním exogenní kyselimy arachidonové (AA) II. ovlivněním produkce eikosanoidů s využitím inhibitorů: LPO nebo CO nebo P450 TGF- b1 TGF- b1 TNFa TNFa TGF-b1/ TNFa TGF-b1/ TNFa diferenciace (+) po indukci do: granulocytů nebo monocytů - makrofágů + - MEK1 According to: Rizzieri: Drug Resistance Updates; 1: 359 - 376, 1998 Environmental Stress UV light Ionizing Radiation Chemotherapy Xenobiotics O2, TM, Heat Cytokines MEKK1 ROS SEK1 ERK1/2 p53 ? Ceramide PKC Apoptosis NFkB DNA damage c-jun, c-fos antioxidants HSP AT DNA-PK c-Abl Ku MDM2 GADD45 p21 PCNA replication E2FRb-PiRbE2F G1 Arrest c-Abl S phase Replication ROS JNK/SAPK c-Jun, ATF2 c-myc ras Raf-1 GPL SPL NFkB Caspases Apoptosis bax Bcl-2 Cytokines Fas-ligand TNF-alpha Mitogens Growth Factors Hormones Serum Nutrient/GF Deprivation ? Heat receptory růstové signály molekuly signálové transdukce molekuly zesilovací kaskády regulátory transkripce cykliny CDKs p27 p21 p16 p15 Cytokiny Přestože cytokiny představují velmi heterogenní skupinu proteinů, lze uvést některé jejich společné charakteristiky: SPOLEČNÉ CHARAKTERISTIKY CYTOKINŮ 1) Nízká MW (< 80 kDa), často bývají glykosylovány (glykoproteiny) 2) účastní se imunity a zánětu, kde regulují intenzitu a délku trvání odpovědi 3) jsou produkovány - lokálně, po přechodnou dobu 4) působí spíše autokrinně a parakrinně 5) jsou vysoce účinné (pM) 6) interagují vysoce specificky s povrchovými receptory 7) po vazbě na receptory indukují syntézu mRNA a receptorových proteinů 8) působí v síti, kde - svoje efekty vzájemně ovlivňují (zejm. svoji produkci) - indukují transmodulaci povrchových receptorů - mohou působit na buněčné funkce aditivně, synergicky anebo antagonisticky cytokin zdroj působení PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH CYTOKINŮ - 2. IFN a 1 IFN a 2 dvojitě negativní lymfocyty, monocyty, makrofágy zvyšuje rezistenci proti virům; inhibuje proliferaci normálních i nádorových buněk; indukuje syntézu MHC I, receptoru pro Ig; aktivuje NK-buňky IFN b 1 fibroblasty, buňky epitelu stejně jako u IFN a IFN b 2 fibroblasty, monocyty IFN g T – buňky, NK-buňky podobná jako u IFN a a b, navíc má větší schopnost aktivovat makrofágy, zvyšovat odolnost vůči parazitům; indukuje syntézu MHCI i MHCII;stimuluje syntézu IgG2 a inhibuje syntézu IgG2 a IgE B-buňkami TNF a makrofágy, T-buňky, thymocyty, B-buňky, NK-buňky působí nekrózu různých typů buněk, převážně nádorových; pleiotropní účinky na široké spektrum buněk, např. reguluje proliferační a funkční odpověď B- a T-buněk; stimuluje diferenciaci prekurzorů myeloidní řady; stimuluje expresi cytokin, MHC a prostaglandinů TNF b T – buňky má stejné účinky jako TNF a G-CSF monocyty, makrofágy, T-buňky, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje proliferaci kolonií granulocytů; aktivuje granulocyty GM-CSF T-buňky, monocyty, makrofágy, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje proliferaci prekurzorů granulocytů, makrofágů; aktivuje makrofágy, neutrofly, eozinofiy M-CSF monocyty, makrofágy, fibroblasty stimuluje růst kolonií monocytů a makrofágů; aktivuje monocyty EPO ledviny stimuluje růst kolonií erytrocytů a megakaryocytů TGF b krevní destičky, kosti matrix, placenta, ledviny, některé nádory reguluje růst buněk (většinou inhibuje proliferaci vyvolanou působením hematopoietických cytokinů) stejně jako u IFN a cytokin zdroj působení PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH CYTOKINŮ - 1. IL - 1 monocyty (+ téměř všechny buňky s jádrem) pyrogen, komitogenní faktor T-buněk; stimuluje uvolnění lymfokinů T-buňkami; aktivuje NK-buňky;stimuluje diferenciaci B-buněk IL – 2 T – buňky růstový faktor T-buněk a thymocytů, zvyšuje cytotoxicitu, aktivuje NK-buňky, stimuluje diferenciaci B-buněk IL - 3 T-buňky (+ žírné buňky) stimuluje proliferaci prekurzorů granulocytů, erytrocytů, megakaryocytů, makrofágů; aktivuje monocyty a makrofágy IL - 4 T – buňky stimuluje syntézu IgG1 a IgE B-buňkami, proliferaci makrofágů, NK-buněk, T-buněk IL - 5 T – buňky stimuluje diferenciaci a růst eozinofilů, proliferaci T- a B-buněk IL - 6 T – buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje syntézu Ig B-buňkami; stimuluje proliferaci thymocytů, prekurzorů neutrofilů, makrofágů, megakaryocytů, myelomu, plazmacytomu, B-lymfomu IL - 7 buňky kostní dřeně stimuluje proliferaci prekurzorů B- a T-buněk a T-buněk IL - 8 monocyty, makrofágy, lymfocyty, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje chemotaxi neutrofilů a dalších leukocytů IL - 9 T-buňky stimuluje proliferaci T-buněk bez přítomnosti antigenu a APC IL - 10 T-buňky (+ žírné buňky) Inhibuje syntézu některých cytokinů (IFN g) IL - 11 buňky kostní dřeně stimuluje proliferaci multipotentních prekurzorů leukocytů (synergie s IFN g) a prekurzorů megakaryocytů (synergie s IL – 3) IL - 12 B-buňky stimulace NK-buněk, cytolyticých T-buněk, T-buněk aktivovaných lymfokiny cytokiny jsou polyfunkční + G-CSF ++ GM progenitor cell mature granulocytes GM progenitor cell mature macrophages mature granulocytes mature granulocyte myeloblast mature granulocyte phagocytosis superoxide G-CSFG-CSFG-CSF GM-CSF M-CSF IL-6 multi-CSF SCF (a) (d)(c)(b) (a) cell production is dependent on regulator stimulation (b) induction of commitment to form cells in a restricted lineage (c) initiation of maturation (d) stimulation of functional activity cytokiny jsou polyfunkční - Úloha IL – 1 v hematopoéze T-cells endothelial cells fibroblasts epithelial cells IL-1 GM - CSF ELAM - 1 ICAM - 1 IL - 2 IL - 6 G - CSF 1. monocyte production and activation 2. proliferation of committed progenitor cells (BFU-E, CFU-GM) 1. neutrophil activation 2. neutrophil production 3. stem cell activation 1. T - cell growth 2. Ig secretion adhesion of leukocytes to other cells clonal expansion of differentiated B - cells ELAM - endothelial leukocyte adhesive molecule ICAM - intercellular adhesive molecule „Network“ interakcí cytokinů GM - CSF T cell B cell macrophage Bone marrow IL - 3 IL - 1 IFN - g IL - 2 IL - 4 IL - 1 LPS TNF (-)TNF G - CSF Antibody Autoregulace uvnitř systému granulocytů - makrofágů CFU - C MG CFU - C MG CFU - C MG CFU - C (GM - CFC) CSF CSF CSFPGE2 CSF CBA inhi- bitor +různé koncentrace CSF zpětnovazebná stimulace a inhibice PGE produkce inhibitoru tvorby CSF G - granulocyty M - makrofágy Spolupůsobení „regulátorů růstu“ rozdílné chemické povahy some interactions of TGF-b1 and AA metabolism with other regulatory molecules which should be studied (unknown effects) effect + lipoxygenase inhibitors (MK886, esculetin) + differentiation agents (TPA, RA, DMSO) lipoxygenases leukotrienes cell membraneTGF-b1 receptor serin - threonin kinase arachidonic acid induction of differentiation inhibition of proliferation G1 SDNA synthesis unknown well documented cell cycle turnover cytosol nucleus EETs HETEs diols prostaglandins thromboxanes p21 c-myc c-fos? ? ? ? ?(G1 cyclins) p27 p27 Rb Rb cyclin E cyclin E cdk2 cdk2 P P ? cyclooxygenases P450 TGF-b1 některá OBECNÁ VÝCHODISKA, DŮLEŽITÁ PRO POSTIŽENÍ CHOVÁNÍ A SMĚROVÁNÍ BUNĚČNÝCH POPULACÍ, Z NICHŽ LZE VYCHÁZET, MOHOU BÝT TATO: - Zachování rovnováhy v nejširším slova smyslu mezi produkcí buněk (intenzitou proliferace) a jejich úbytkem (např. smrtí apoptózou) je podmínkou pro zachování homeostázy na tkáňové úrovni. - Proto změny v intenzitě proliferace, diferenciace a apoptózy po působení jakýchkoli podnětů, jež mohou tyto procesy ovlivnit, lze chápat jako integrální ukazatele porušení této homeostázy. - Vhodný způsob detekce těch změn, které vedou k trvalejšímu porušení rovnováhy mezi produkcí a úbytkem buněk může celkově odrážet nejen poruchy, které jsou základem tzv. proliferativních chorob (nádorových onemocnění), ale být i ukazatelem procesů vedoucích k obnově porušené rovnováhy. - Parametry, jimiž lze postihnout tyto tendence, by proto měly být předmětem zájmu nejen teoreticky orientovaných pracovníků, ale i laboratoří zabývajících se účinky škodlivých látek vnějšího prostředí, šlechtitelských a zejména klinicky orientovaných laboratoří.