Enzymy používané při manipulaci s nukleovými kyselinami doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2012 Obsah přednášky 1) Přehled a funkce enzymů 2) Reštrikční endonukleázy - opakování 3) Reštrikční mapy 4) Detekce polymorfismů v genomech 5) DNA fingerprinty 6) Proteinové fingerprinty Doporučená literatura GENE CLONING & DNA ANALYSIS Sixth coriON Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition katalog firmy New England Biolabs, USA, www.neb.com T.A.BROWN DNA polymeráza I > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3- 5' Klenowův fragment > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3 - 5' > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5' 3' Další enzymy - / Terminální deoxyribonukleotidyltransferáza 5' 3' <4 Zpětná transkriptáza mRNA ssDNA ^ Fosfatázy a kinázy Fosfatázy - Alkalická fosfatáza (telecí střevo) (E.coli infikované bakteriofágem T4) Ligáza T4 DNA ligáza (E. coli infikované bakteriofágem T4) OH + 2 x ATP 3' Ligáza Ligace - spojení dvou fragmentů DNA 5' ATTC ... 3 3'... CTTA 5' . . 3' . . GA ATTC // CTTA AG AG ... 5 samovolné připojení . 3' . 5' spojení ligázou 5'... GAATTC ... 3 + 2 x ATP 3' . . . CTTAAG ... 5 Exonukleáza III (E. coli) > exonukleázové odbourávání ve směru 3- 5' > odbourává 3 - OH konec Exonukleáza Bal 31 > štěpí lineární dsDNA z obou konců > zkracuje DNA fragmenty > konce jsou zarovnané S1 nukleáza (Aspergillus oryzae) > specifická pro ssDNA > odstraňuje jed n o řetěze e na dsDNA Deoxyribonukleázy DNáza I (hovězí pankreas) > nespecifická > vytváří jednořetězcové zlomy > následně DNA odbourává na mono a oligonukleotidy DNáza I Ribonukleázy > nespecifické i specifické > odbourávají RNA > používají se k odstraněné RNA ze vzorků s DNA > extrémně stabilní enzymy Reštrikční endonukleázy Co to jsou reštrikční endonukleázy Enzymy, které štěpí dsDNA ve specifických místech, specifických sekvencích > součást reštrikčné modifikačních systémů bakterií > omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech > DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní RE chráněna metylací > původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem chromozóm Qfá9 chromozóm je metylován — O RE ničí | vstupující 'dna degradovaná fágová DNA Dělení restrikčních endonukleáz Typ I - rozpoznávají specifickou sekvenci, štěpí v nahodilém místě Typ II - přísně specifické, rozpoznávají a štěpí sekvence s rotační symetrií (palindrom) Typ III - rozpoznávají nesymetrické sekvence a štěpí v jiném místě v definované vzdálenosti Typ IV - štěpí mimo rozpoznávanou sekvenci, která musí být modifikována Restriktázy typu II Rozpoznávají palindromy a štěpí ve stejném místě > vážou se na specifické (4-8 pb) sekvence nukleotidů > katalyzují štěpení obou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství > štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA > molekulová hmotnost: 20 000 až 100 000 > kofaktor: pouze ATP Jak vypadá palindrom? Přilehlá obrácená repetice 5'.....ATGC/GCAT.....3' 3'.....TACG/CGTA.....5' Vlásenka ATGCGCAT Jak funguje RE typu // 5' 3'... CT 5' . . ATTC ... 3 3'... CTTA AG ... 5 Je známo přes 3 500 RE, rozpoznávají asi 160 různých sekvencí Různé typy konců lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 5'- koncích, EcoR I 5'... GA 3' 5' ATTC ... 3' 3' . . . CTTA 5' 3' AG ... 5' lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 3'- koncích, Pvu II 5' . . . CGAT 3' 5' CG ... 3' 3'... GC 5' 3' TAGC ... 5' zarovnané (tupé) konce, Stu I 5 ' . . . AGG 3 ' 3 ' . . . CTT 5' 5' 3' CCT ... 3' GGA ... 5' Podívejte se na animace http://www.dnalc.org/ddnalc/resource s/animations.html http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072437316/student_view0/chap terl 6/animations.html Nebo si vyžádejte staženou prezentaci Existuje i procvičovací pps soubor Pro štěpení je důležitá orientace! 5 ' NGAATTCN 3 ' + EcoR\ 3 NCTTAAGN 5' 5 ' NCTTAAGN 3 ' + ^COR\ -> 3'NGAATTCN 5' 5 NCTTAAGN 3' + Affl -> 3'NGAATTCN 5' 5'NGA ATTCN 3' 3'NCTTA AGN 5' žádné štěpeni 5'NC TTAAGN 3' 3'NGAATT CN 5' Relaxovaná specifičnost Star activity Některé restriktázy za určitých reakčních podmínek štěpí blízce příbuzné sekvence EcoR\ 5'... G AATTC ... 3' 5'... G G ATTC ... 3 5...GGATTT...3 5...AGATTT...3 Důsledky relaxované specifičnosti > nespecifické produkty > často za neoptimálních reakčních podmínek PvuII PvuH PvuO-HF II 1 Ihr oln " 1 hr ofn " 1 hr o/n ' M nerozštěpené fragmenty DNA Zkuste vypočítat Jedna jednotka reštrikční endonukleázy BamH\ je množství enzymu, které rozštěpí 1 |jg DNA fága A za optimálních reakčních podmínek při 37°C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága A je celkem 5 štěpných míst pro restriktázu BamHL Chceme-li linearizovat plasmid, který obsahuje jediné reštrikční místo pro tuto restriktázu, jaké podmínky štěpení použijeme? Máme linearizovat 1010 molekul plasmidu. Řešení je zde Dokument ikace Mcrosoft W< Názvosloví restrikčních endonukleáz např. Eco I > 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie > 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie > označení kmene (serotypu produkční bakterie (ne vždy) > římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie Počet rozpoznávaných sekvencí pro určitou reštrikční endonukleázu na DNA o známé délce můžeme vypočítat Jak často se vyskytuje čtveřice? Předpokládáme, že .... > máme nekonečně dlouhou molekulu > sekvence nukleotidů je naprosto nahodilá Máme 4 nukleotidy a děláme z nich čtveřice 44 = 256 bp Restriktázy štěpí nejčastěji čtveřice nebo šestice nukleotidů Jaká je frekvence výskytu štěpícího místa pro restriktázu EcoR I (štěpí sekvenci GAATTC) ? Frekvence výskytu štěpícího místa pro restriktázu EcoR I je 1 ku 46 46 = 4 096 (bp) Šedivá je teorie a zelený strom života Reálná situace DNA fága A -> 49 kbp -> 12 míst pro RE štěpící hexamery 10 20 30 40 49 _I Bgl\\ BamHl Sal\ BgH\ 22 010 13 286 9 698 2 392, 651,415, 60 BamHl 7 233 6 770 6 527, 5 626, 5 505 Sa/l 32 745 15 258 16 841 499 Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejích velikostí Number of restriction sites DNA Genome source size (kb) 4bp 6bp 8bp 1 pUC19 3 10 0-1 0-1 2 SV40 5 20 1 0-1 3 Bacteriophage X 48 190 12 0-1 4 Bacteriophage T4 165 660 40 2-3 5 Bacteria 4700 18400 1100 70 6 Yeast* 16000 62500 390Ó 250 7 Fruit fly* 120000 470000 30000 1800 8 Mammals* 3000000 11700000 730000 46000 * Haploid values (most somatic cells have twice as much DNA) Homing endonucleases Nukleázy, které štěpí dsDNA a rozpoznávají dlouhé nesymetrické sekvence (12-40 nukleotidů) a kódující sekvence intronů a inteinů > Názvosloví jako u restriktáz s prefixem I- nebo Pl- > Štěpí s extrémně nízkou četností > Nejsou příliš specifické, proto je průměrná frekvence štěpení jako by rozpoznávaly 10-12 bp l-Ceul, l-Scel, Pl-Pspl Vypočítejte Jestliže je počet nukleotidů v diploidním genomu člověka roven přibližně 3 miliardy párů bází, jaká je nejmenší délka sekvence, která se v takovém genomu bude vyskytovat pouze jedenkrát? Řešení je zde Dokument ikace Microsoft W< Význam restrikčních endonukleáz > nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA > prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu > základ pro genové inženýrství > fyzikální mapování DNA > analýza populačních polymorfizmu > změny v uspořádání molekul DNA > příprava molekulárních sond > příprava mutantů > analýza modifikací DNA Mnoho dalších informací k restriktázám najdete na http:rebase.neb.com/rebase/ Rozřezání genomu endonukleázami Reštrikční fragmenty Fragmenty vzniklé restrikčním štěpením lze rozdělit elektroforézou 1) Velikost jednotlivých fragmentů můžeme stanovit elektroforézou 2) Jednotlivé fragmenty můžeme poskládat a vytvořit tzv. reštrikční mapu Skládání reštrikční mapy Reštrikční štěpení lokusu reštrikční místa X (nebo delece) X -h Získané fragmenty lze uspořádat více způsoby Původní pořadí = A-B-C Další možnosti A-C-B C-A-C-B- Mapy se skládají po štěpení více restriktázami >po štěpení restriktázou Xba I jste získali fragmenty o velikosti 300, 500 a 900 bp >po štěpení restriktázou Ava I fragmenty o velikosti 700 a 1 000 bp >po štěpení oběma restriktázami současně fragmenty o velikosti 100, 300, 400 a 900 bp Mapy se skládají po štěpení více restriktázami Ava I Xbal 700 300 500 10C 300 400 1 000 900 900 700 1 000 400 300 100 900 300 500 900 700 1 000 300 400 100 900 300 500 900 Výsledná mapa Ava 1 700 1 000 300 400 100 900 Xbal 300 500 900 Xbal Xbal Ava I 300 500 900 300 400 100 900 700 1 000 Vytvoření reštrikční mapy po parciálním štěpení Co je to parciální štěpení B 12 A , I B I I C 11 10 B A B ■ A i 1 Příklad parciálního štěpení 1) Po částečném štěpení DNA bakteriofága A restriktázou Kpn\ jste získali fragmenty o velikosti 1,5; 17,0; 18,5; 30,0; 31,5 a 48,5 kbp. 2) Úplným štěpením jste získali fragmenty 1,5; 17,0 a 30,0 kbp. 3) Sestavte reštrikční mapu. Z daných výsledků lze odvodit 1) Fragment 48,5 odpovídá neštěpené molekule fága 2) Fragmenty 1,5; 17,0; a 30,0 jsou produkty kompletního stepem 3) Fragmenty 18,5 a 31,5 kbp jsou produkty částečného stepem Reštrikční mapa pro Kpn\ musí být 30,0 1,5 17,0 A teď si to ještě procvičte Jestliže z předchozího příkladu znáte reštrikční mapu pro Kpn\, pak vytvořte reštrikční mapu pro Kpn\, Xba\ a Xho\ podle výsledků shrnutých v tabulce Enzym Počet fragmentů Velikosti (kbp) Xba\ 24,0; 24,5 Xho\ 2 15,0; 33,5 Kpn\ 3 1,5; 17,0; 30,0 Xba\ + Xho\ 3 9,0; 15,0; 24,5 Xba\ + Kpn\ 4 1,5; 6,0;17,0; 24,0 Postup řešení 1) DNA fága A je lineární, proto jsou počty restrikčních míst pro jednotlivé restriktázy rovny: Xba\ = 1, Xho\ = 1, Kpn\ = 2 2) Fragmenty pro Xba\ a Xho\ jsou následující: Xba\ Xba\-Xho\ Xho\ MAPA 24,0 24,5 9,0 15,0 24,5 15,0 33,5 Xho\ Xba\ 15,0 + 9,0 24,5 3) Všechna místa pro Kpn\ jsou ve fragmentu Xba\ (24,5), protože se tento fragment po štěpení Xba\-Kpn\ neštěpí. Pořadí míst Kpn\ je určeno z částečného štěpení. Výsledná mapa Xho\ Xba\ Kprú H- 15,0 9,0 "6,0 1,5 17,0 Využití restriktáz a PCR - detekce poíymorfismů v genomech mikroorganism ů > Krátké fragmenty = RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů > Dlouhé fragmenty = PFGE - pulsní gelová elektroforéza > Analýza produktů PCR = PCR-REA > Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů = AFLP > Polymorfismy konformace SSCP, DSCP RFLP = polymorfismus délky restrikčních fragmentů Tuto část probereme v rámci přednášky o hybridizaci PFGE Pulsní gelová elektroforéza > určena k dělení velkých fragmentů DNA a chromozómů (nad 50 kbp, stovky kbp, megabáze) Aparatura na PFGE Pěkná animace znázorňující pohyb DNA v pulsním poli je na http://www.bio.davidson.edu/cours es/qenomics/method/pulse field.ht ml Jak se provádí PFGE 1) Buňky se naředí na vhodnou koncentraci 2) Buňky se zalijí do agarózy 3) Agarózové bločky se opracují enzymy - lyže. deproteinace 4) Na genomovou DNA v bločcích se aplikují restriktázy Jak se provádí PFGE 5) Bločky s rozštěpenou genomovou DNA se + Příklad aplikace PFGE Diferenciace mykobakterií po štěpení Nott b c li-li-1 > nástroj pro epidemiology a epizootology > stanovení fylogenetické příbuznosti > nezbytná počítačová analýza dat ! porovnej s RFLP ! Jiný příklad aplikace PFGE Diferenciace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po štěpení SnaBX, Spe\ > Pokus odlišit RFLP typy B-C1 Diferenciace Mycobacterium avium subsp. hominissuis po štěpení Xba\, Dra\ > Studium genetické diversity kmenů izolovaných u pacientů s AIDS Jak se vyhodnocují fragmenty získané po PFGE? Analýza změn ve fragmentu 4 000 bp Velikosti fragmentů 6000 5000 4000 2500 2000 1500 1000 750 Počet změn + RE - RE + 50 - 50 4000 2500 6000 4500 3500 1500 i i ] [ i i ] [ Vliv mutace na RFLP spektrum Mutace Výsledek > bodová +RE > bodová -RE > inzerce > ztráta fragmentu + 2 nové > ztráta 2 fragmentů + 1 větší nový > stejný počet fragmentů, ale jeden se „prodlouží" o délku inzerce > delece > stejný počet fragmentů, ale jeden se „zkrátí" o délku delece Kritéria pro epidemiologii Kategorie Počet genetických změn Počet změn v PFGE Epidemiologie Neodlišitelné Součást ohniska Blízce příbuzné 1 2-3 Pravděpodobně (probably) součást ohniska Asi příbuzné 2 4-6 Možná (possibly) součást ohniska Odlišné >3 > 7 Mimo ohnisko Tenover et al. (1995): Journal of Clinical Microbiology 33 (9), 2233-2239 Stejná pravidla platí pro RFLP Analýza methicilin rezistentních S. aureus pomocí PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis Příklad PFGE pro MRS A Štěpení restriktázou Sma\ Dar et al. (2006): Molecular epidemiology of clinical and carrier strains of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the hospital settings of north India. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 5:22 Typizace salmonel pomocí PFGE Štěpení restriktázou Bln\ De Lappe et al. (2009): Role of subtyping in detecting Salmonella cross contamination in the laboratory. BMC Microbiology 9:115 Shigella flexneri a Shigella sonnei * t «•> w est. «•* mm >» «* m m ■"^ '!» flc $t ;SK IK X s s s I ■ i 1 * SSI i •«•»»'•■ «ik 5F *"* Jt> At _ mk. 4fe Dvou krokový identifikační protokol > Thierry etal. 1990 > PCR produkt o délce 1 300bp > Štěpení Rsa\ a Cfo\ Dvorská et al., Vet. Med. Czech, 2002, 46, 309-328 Výsledky diferenciace pro 16S rRNA Rsa\ Cfo\ Rsa\, Cfo\ M. tuberculosis M. bovis M. intracellulare M. gordonae M. ulcerans Corynebacterium Rhodococcus Gordonia Nocardia M. avium M. ulcerans M. intracellulare M. terrae M. bovis M. bovis caprae M. fortuitum complex M. kansasii M. chelonae serotypes Velikosti fragmentů po štěpení Rsa\ Druh Velikost fragmentů M. xenopi 780 355 113 M. ulcerans 600 467 167 M. terrae 391 355 167 167 113 M. parafortuitum 373 355 171 167 113 M. flavescens 421 355 171 167 113 M. fortuitum 421 355 171 167 113 MAC 556 355 167 113 MTBC 617 355 171 167 113 Velikosti fragmentů po štěpení Cfo\ Druh Velikost fragmentů M. terrae 410 337 314 252 M. parafortuitum 408 343 314 252 M. flavescens 408 337 253 225 M. fortuitum 408 253 225 190 145 M. avium 408 337 312 253 M. paratuberculosis 408 337 312 253 M. intracellulare 408 312 253 187 139 M. scrofulaceum 408 309 253 187 150 Na elektroforetickém snímku jsou velikosti restrikčních fragmentů amplikonu ze 16S rRNA po štěpení restriktázou Rsa\ Určete přibližně, z jakého druhu bakterie pocházela DNA L = velikostní standard Délky fragmentů v L = 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000,1200 a 1500 bp Řešení 1,2 = není jasné 3, 6, 7, 8,12 = M. tuberculosis 4 = M. xenopi nedoštěpený 5,10,13,14 = nelze stanovit 9 = M. terrae, M. parafortuitum 11 = M. terrae, M. parafortuitum, nedoštěpený 15 = M. flavescens, M. fortuitum Řešení - jiný zápis 1,2 = není jasné 3 = M. tuberculosis 4 = M. xenopi nedoštěpený 5 = nelze stanovit 6, 7, 8 = M. tuberculosis 9 = M. terme, M. parafortuitum 10 = nelze stanovit 11 = M. terme, M. parafortuitum, nedoštěpený 12 = M. tuberculosis 13,14 = nelze stanovit 15 = M. flave seen s, M. fortuitum Detekce genů rezistence Gen Metoda K čemu katG PCR-REA, RFLP INH resistence u MTBC pncA, oxyR PCR-REA sekvenování PCR-RFLP rezistence k pyrazinamidu tuberculosis x bovis ahpC sekvenování MDR-M7B PCR-REA - závěry Výhody > Jednoduchá, levná a rychlá metoda > Univerzální, vhodná pro široké spektrum organismů Nevýhody > Nutné mít sadu standardních druhů, poddruhů a kmenů > Bodové mutace během PCR > Nízká rozlišovací schopnost elektroforézy Kdo chce vědět víc Dvorská L, Bartoš M., Martin G., Erler W., Pavlík, I. (2001): Strategies for differentiation, identification and typing of medica important species of mycobacteria by molecular methods. Protein fingerprinting > Dvourozměrná proteinová elektroforéza > Nejnověji hmotnostní spektrofotometrie Elektroforéza proteinů - 2D-SDS Izoelektrická fokusace nízké pH vysoké pH - proteiny + proteiny SDS PAGE Příklad 2D elektroforézy E. coli FtsH deficientní kmen produkující a-glukozidázu <0 o 5 70 SO 40 -30 - Drir. OrotL -v. ölUCPi M fan _ oiucPi ^. ÍWCPl ■vi GllKPl oiucw • " ♦ i otocři OmpT GLUCP1 giucpi ^ ^9 GllKPl GIUCP1 20 -4 10 giucp1 4.5 ibpe —r 5 5.5 6 pH Jürgen, B. et al.: (2010): Quality control of inclusion bodies in Escherichia coll Microbial Cell Factories 2010, 9:41 Protein mass fingerprinting Analytická metoda pro identifikaci proteinů vyvinutá v roce 1993 > Protein je nejprve štěpen na menší peptidy > Jejich hmotnost je změřena hmotnostním spektrofotometrem (MALDI-TOF, ESI-TOF) > Následuje porovnání výsledných hmotností s databází hmotností referenčních peptidů Protein mass fingerprinting Proboha jak? Srovnávací vzorek referenčních peptidů lze připravit rovněž in silico ! In silico příprava referenčních peptidů ATG CAA TAG TTC AAG AAA GAT AGT TAA Translace in silico Met-Leu-Cys-Thr-Asp-GIn-His-lle I Specifické štěpení ^ známou proteázou Met-Leu-Cys-Thr Asp-GIn-His-lle Výpočet molekulové Porovnání se hmotnosti ^ vzorkem Princip MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption ionization time-of- flight > varianta hmotnostní spektrofotometr i e > peptidy jsou ionizovány a stanoví se poměr hmoty k náboji na základě doby letu (time-of-flight) k detektoru > vypočte se M a ta je specifická pro každou aminokyselinu Tim»-ot-flight mast sptc Schéma zařízení Target plate spotted with proteins of interest Pulsating light Detection Sample plate / \ Laser Reflection / r -IÜ -in ■ i in 11 ■ i in ■ ■■■ an Ionisation 1 Protein identification Výhody a nevýhody 1) Není zapotřebí sekvenovat proteiny 2) Stačí jen znalost molekulové hmotnosti 1) Nelze analyzovat multimerní proteiny 2) Vzorky se izolují z SDS-PAGE Příprava vzorku pro spektrofotometru 1) SDS-PAGE 2) Chemická modifikace - odbourání disulfidických můstků, karboxymetylace cysteinů 3) Štěpení proteázami 4) Extrakce peptidů acetonitrilem a vakuové vysušení 5) Rozpuštění ve vodě 6) Purifikace a úprava pro spektrofotometrii Výsledek MALDI-TOF Abs. Int.* 1000 15 10 6 1226.59 35-44 1342.64 570-581 1467.83 "361-372 1371.58 384-396 1149.63 66-75 1311.74 362-372 1055.59 161-168 L u 1262.63 187-198 ■ ■ ■ L.i_ 1639.92 438-452 1623.77 348-360 ILU 1657.74 1Ü8-130 1898.98 "170-184 1742.89 170-183 1853.89 (509-524 - 1 ■■ 1910.93 "123-138 2045.12 397-413 2545.19 469490 2593.25 139-160 2487.17 525-545 2402.05 45f* Ji JLi 2674.31 139-161 1500 2000 ~r oj 1250 1750 2250 2500 2750 m/z Protein View | Match Errors | MSMS Fragments | MSMS Analysis | Protein: HUMALBGC NIC': g178343 - human. Intensity coverage: 62.5 % (79242 cntsj Sequence coverage MS: | 52.3% Sequence coverage MS/MS: I 0.6% Peak threshold: TUB MW(kDa): 0.0 0.0 10 20 30 40 50 60 70 80 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE EHFKALVLIA F AQ YLQQCP F EDHVKLVNEV TEFAKTCVÄD 90 100 110 120 130 140 150 160 ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDHPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK 170 180 190 200 210 220 230 240 KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV 250 260 27 0 280 290 300 310 320 ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHC1AEVEHD 330 340 350 360 37 0 380 390 400 EMPADLPSLA ADFVESKDVC KHYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHP DYS VVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE 410 420 430 440 450 460 47 0 480 FKPLVEEPQH LIKQHCELFE QLGEYKFQHA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRHLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV 490 500 510 520 530 540 550 560 LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVHRRP CFSÄLEVDET YVPKEFHAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHK 57 0 580 590 600 610 PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEPTMRI RERK Shrnutí 1) Přehled a funkce enzymů 2) Reštrikční endonukleázy - opakování 3) Reštrikční mapy 4) Detekce polymorfismů v genomech 5) DNA fingerprinty 6) Proteinové fingerprinty