Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent Andrea Tóthová Co se tady bude dít.. •proč DNA a jak to s ní vlastně bylo... •Přehled základních metod •Sekvencování NK •Sbírání dat a co pak s nima, tvorba knihoven, GenBank, AToL •Zásady bezpečné práce v laboratoři • • Co tady budem používat... GeneRunner Sequencher – placený SW MEGA Paup - dtto MrModeltest MrBayes RAxML Garli Mesquite CIPRES FigTree TreeView TNT http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html Co je molekulární biologie? Co je molekulární fylogenetika? Jsou kladistika a fylogenetika sestry? Od biologie k molekulární biologii •Molekulární biologie - studium struktury a funkce genu na molekulární úrovni pro pochopení základu dědičnosti, genetické variace a exprese znaků genů •Překrývá se s dalšími oblastmi, jako např. genetika a biochemie • •Fylogeneze (vznik a vývoj jednotlivých vývoj. linií) – kladogeneze (pořadí a způsob větvení VL) a anageneze (hromadění fenotypových změn ve VL) •Last Universal Common Ancestor •Větve, uzly, stromy… •Homoplázie (znak nepřítomen u společ.předka) a homologie (znak zděden od nejbližšího předka) •Plesiomorfie a apomorfie •Co na to Haeckel a von Baer? – pravidlo rekapitulace Molekulární znaky mají oproti klasickým řadu výhod: • Je jich libovolné množství • Jsou vzájemně distinktní, kvalitativní, na sobě nezávislé • Umožňují srovnávat i nepříbuzné organizmy • Jsou selekčně neutrální, není nutno je vážit Molekulární fylogenetika využívá molekulárněbiologické znaky pro účely fylogeneze a systematické biologie Jak to vše začalo… •bakteriofág…chromatografie…dvouzávitnice... •Jak to s DNA vypadá •Dvouzávitnice – stavba - primární a •sekundární struktura Začátky molekulární biologie •Moderní molekulární biologie začíná v 30. letech konvergencí dalších biologických disciplín, jako biochemie, mikrobiologie, genetika a virologie s nadějí pro pochopení života a jeho nejzákladnějších procesů – mnoho fyziků a chemiků obrátilo svou pozornost na nové možnosti využití známých postupů k objevování „neviditelného světa“ DNA - dědičnost a struktura •To, co dnes víme o DNA, nebylo objeveno přes noc •Mnoho různých vědců přispělo k výzkumu a jejich zásluhou dnes nejen známe model DNA, ale taky můžeme předpovědět další zatím neznámé „věci“ Jedni z prvních… •Genetický materiál je DNA – Alfred Hershey a Martha Chase, 1952 •Do té doby byly proteiny považovány za původce přenosu gen. informace •Hershey a Chase pracovali s viry, které napadaly bakterie – bakteriofágy •Série experimentů prokázala úvodní konstatování Martha Chase a Alfred Hershey Wilkins a Franklin •M.H.F. Wilkins a Rosalind Franklin, 50.léta •Wilkins a Franklin studovali strukturu DNA krystalů pomocí X-paprsků •Zjistili pravidelně se opakující oblasti v krystalu •Vzorek DNA obsahuje struktury o rozměrech 2 nm, 0.34 nm, a 3.4 nm. Tmavé struktury na vrcholu a spodku se opakovaly indikujíc závitnici Rosalind Franklin Konečně.. •James Watson a Francis H.C. Crick, 1953 •Watson and Crick použili Chargaffovy základní data a Franklinovy výsledky z röntgenové analýzy a sestrojili model DNA •Model ukázal, že DNA je double helix s cukro-fosfátovou kostrou, na kterou se zevnitř připojují nukleotidy •Chargaffovo pravidlo ukázalo komplementaritu párování bazí A = T a G = C, tedy purinů s pyrimidiny, co dalo dvouzávitnici správnou šíři •Párování bazí může proběhnout v libovolném pořadí, což umožňuje nekonečnou diversitu sekvence • První dokument o DNA publikován v Nature 25. dubna 1953 Chargaffovy pravidla •Base-pairing pravidlo je A-T and G-C •Thymine je nahrazen Uracilem v RNA •Báze jsou navzájem spojeny vodíkovými můstky •Bylo objeveno díky relativnímu obsahu jednotlivých bazí (obsah A-T je podobný a C-G totéž) Erwin Chargaff •Double Helix – stočený řebřík •Tvořen monomery AKA nukleotidy •Nukleotidy sestávají z: –Deoxyribosového cukru –Phosphátové skupiny –Dusíkaté báze •dva typy: –Puriny –Pyrimidiny –Puriny: –Adenine a Guanine –Pyrimidiny: –Thymine a Cytosine DNA je nekonečná struktura •„Šprušle“ řebříku můžou jít za sebou v libovolném pořadí (zákon komplementarity musí platit) •4 báze mají v nekonečné množství kombinací Základ všeho.. •Kostra tvořena střídáním cukru a fosfátu •K cukru se VŽDY připojuje dusíkatá báze •DNA byla nalezena v jádru eukaryot a také v cytoplasmě prokaryot •DNA je „sbalena“ a obtočena kolem speciálních proteinů zvaných HISTONY •DNA obalující protein tvoří komplex zv. CHROMATIN •Když chromatin zkondensuje (ztloustne), tvoří CHROMOSOMY supercívka chromozom cívka nukleozom histony DNA dvouzávitnice Centrální dogma molekulární biologie 7-INTODUCTION DNA tvoří kopie sebe samé •Replikace – proč je potřeba? • Jednoduché: v každém organizmu se buňky dělí, aby byl zabezpečen růst a reprodukce organizmu, tudíž nové buňky potřebují DNA s instrukcemi, jak být buňkou • DNA se replikuje těsně před dělením buňky. Replikace… •DNA se musí rozplést a zrušit vodíkové můstky •Obě rozpletené strany slouží jako templát k replikaci •Z původní dvouzávitnice jsou vytvořené pomocí DNA polymerázy dvě nové vlákna •Počas replikace enzym helikáza „odzipuje“ DNA •Další enzym – DNA polymeráza se posunuje podél vlákna a připojuje komplementární volné nukleotidy • Replikační vidlice růst DNA polymeraza Nové vlákno Původní vlákno Dusíkaté báze DNA Polymeráza DNA – RNA – DNA nekonečný cyklus •RNA má za úkol předání vzkazu od DNA do jádra ribosomů •Transcripce - RNA je vytvořena z DNA •Translace – z RNA je přeložen vzkaz na výrobu proteinů •Díky Chargaffovu pravidlu se začlení pouze komplementární nukleotid, tudiž DNA polymeráza vytvoří perfektní kopii Chyba se stává! à Mutace! Mutace •Substituce – jedna báze nahradí druhou •Inzerce – začlení se extra báze •Delece – ztráta jedné báze Genetický kód •Genetický kód– řeč mRNA s instrukcemi •Čtení třech písmen (dusíkatých bazí) zaráz •Kodón à na mRNA; složen ze tří bází •64 kodonů pro 20 aminokyselin – jsou univerzální pro všechny bakterie, rostliny a živočichy na Zemi • Co je gen? •Základní jednotka dědičnosti; dlouhá část DNA se specifickými instrukcemi pro produkci specifického proteinu •Geny se nachází na specifickém místě chromozomu zvaném lokus Chromozomální variace definuje druh •Chromozom je úložiště genetické informace, počet je druhově specifický •Lidský genom má ca. 3 million kb. •Ne-funkční kodony jsou introny •Funkční jsou exony •