Metody používané v klinické praxi •Metody využívající sérologické reakce – exkurze TEST-LINE firma •Testy funkce a počtu buněk imunitního systému -přednáška VúVl •Základy alergologického vyšetření •Imunologické vyšetření a základy interpretace výsledků imunologických laboratoří -exkurze ve firmě Bioplus? •Příklad vyšetření v laboratořích metody využívající sérologické reakce A. Precipitační metody V kapalinách, v gelu B. Imunodifuzní metody •Jednoduchá imunodifúze •dvojitá imunodifúze C. Imunoelektroforetické metody Kombinace s elfo •Imunoelektroforéza podle Williamse a Grabara, Raketová imunoelektroforéza, Protisměrná, Dvojrozměrná •D. Aglutinační metody E. Hemaglutinační F. Komplementové G. Metody fagocytózy H. Immunoblotting – TeST-LINE Zákalové reakce •Imunonefelometrie •Imunoturbidimetrie H. Imunochemické metody a) RIA b) FIA c)EIA – TEST-LINE Časové rozdělení metod, metody používané v klinické praxi •Metody I.generace •Některé techniky v roztoku – precipitační, aglutinační, HIT, KFR, •Metody II.generace •Kvantitativně i složité směsi antigenu, •Imunodifúze, imunoelfo, latexová aglutinace •Metody III.generace •Velmi citlivé metody, stanoví Ag, Ab i hapteny •Imunoanalýzy – př. RIA, FIA, EIA, imunoturbidimetrie •– nefelometrie, -fluorimetrie (fluorescence), popř jejich kombinace •Metody IV.generace •Kontinuálně měří Ag, Ab i hapteny •imunosenzory •1929 Heidelberg a Kendall – popsali reakci rozpustného Ag s odpovédajícící Ab ve vhodném poměru. •Výsledek reakce – precipitát •Stanovili precipitační křivku a 3 oblasti reakce Ag s Ab Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) Oblast ekvivalence Precipitační metody Oblast nadbytku protilátky Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie turbidimetrie • s markerem EIA, IRMA.. Oblast nadbytku antigenu Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA.. • homogenní EMIT… - faktory ovlivňující precipitaci: · typ Ab /např. IgG/ · teplota – se zvyšující se teplotou se urychluje precipitace /např. 38°C/ · vzájemná koncentrace Ag a Ab · pH · iontový náboj · tvar a velikost části Serologické metody - precipitace •Ag + Ab ® Ag-Ab • precipitinogen precipitin precipitát sraženina •solubilní /rozpustný/ • •- dělíme: •A) v kapalinách : •I. prstencová • – prstenec sraženiny precipitátu • • •II. sklíčková – určení pod mikroskopem •B) v gelu: •IMUNODIFÚZE PRECIPITAČNÍ metody: •využití : ke stanovení Ag, Ab, H •praxe – 1. zjištění výskytu či stanovení Ab v séru při inf. onemocnění 2. identifikace patogena •Koncentrace Ab se vyjadřuje jako TITR SÉRA. • => nejmenší zředění Ab, které ještě reaguje s Ag •- hodnocení : kvalitativně – odečtení okem •· kvantitativně : •a, zjištěním množství precipitátu •b, zjištěním množství Ag v precipitátu či supernatantu •c, změna optických vlastností vzorku – 2 metody : •NEFELOMETRIE –* TURBIDIMETRIE PRECIPITAČNÍ metody: př. Precipitační imunochemické metody Screeningové metody – jednoduché precipitační testy terénní kazetové testy pracující v oblasti ekvivalence S T C S T C Negativní výsledek Pozitivní výsledek Za nepřítomnosti nebo nedostatku drogy ve vzorku moče vytvoří protilátka imunokomplex (precipitát) se značenou drogou vázanou v místě testu T. (S – vzorek, C – kontrola) Využití: Rychlé chromatografické testy – stanovení přítomnosti drogy v tělesných tekutinách , Ab nebo Ag u infekčních nemocí (Chlamydie, Adenovirus, Rotavirus), (Helicobacter pylori, Influenza A,B, Rota a Adenovirus) Imunodifúze - specifická reakce Ag s Ab - precipitace /gel z agaru nebo agarózy/- AGAR ~ směs polysacharidů extrahovaných z červených mořských řas * ® přírodní agar nutno přečišťovat ~ frakcionací vznikají 2 složky:· agaróza - neobsahuje vedlejší aniontové skupiny - pro difúzi více vhodná - standardnější složení než agar a nižší schopnost nespecifické adsorpce · agaropektin - obsahuje aniontové skupiny ® pro difúzi nevhodný imunodifúze •- příprava gelu: • rozvaření agarózy v pufru na vodní lázni •nanesení na skleněné destičky – ztuhnutí ve vodorovné poloze /při teplotě pod 42°C/ •- princip ID: •- vzájemná volná difúze Ab a Ag v gelu na základě koncentračního spádu až do místa střetnutí ~ zde vznikají precipitační linie®obloučky®prstence®kruhy /záleží na použitém materiálu/ •- vzniklé precipitáty detekujeme: •* okem - zákal •* barvením – Coomassie blue, amidočerň •* sekundárními protilátkami •* Au, Ag, radioizotopy •- vznik precipitátů je děj postupný!!! • Imunodifúze - rozdělení imunodifúzních metod: * jednoduchá imunodifúze – gelem difunduje pouze jedna složka –Ag nebo Ab * dvojitá imunodifúze – gelem difundují obě složky– Ag i Ab · jednorozměrná – složka putuje v gelu jedním směrem · dvojrozměrná /radiální/– složka putuje více směry Ag a Ab si neodpovídají – nevytvoří se precipitační linie Směs více typů Ag a Ab – počet linií odpovídá počtu sobě si odpovídajících párů Ab a Ag Imunodifúze •jednoduchá imunodifúze- migruje 1 složka: •1. složka se smíchá s gelem už při jeho přípravě (nemigruje) •2. složka se aplikuje následně do vyřezaných jamek – MIGRUJE – v místě vyrovnání koncentrací vzniká precipitační linie •Jednoduchá jednorozměrná imunodifúze ~ dle OUDINA •- ve spodní části zkumavky agarózový gel s Ab, převrstveno roztokem s Ag - zalito parafínovým olejem – zábrana odpařování •- čím je Ag koncentrovanější, tím dále od roztoku s Ag vznikají precipitační linie /odečitatelnější/ •- využití: · detekce počtu Ag párů roztok s Ag gel s Ab olej Imunodifúze •Jednoduchá radiální /dvojrozměrná/ imunodifúze dle MANCINIOVÉ •- na skleněnou destičku se nalije gel, který obsahuje Ab ® nemigruje • inkubace ve vlhké komůrce ve vodorovné poloze → difúze všemi směry (radiální) • po obarvení - modré precipitační prstence •® čím je vzorek koncentrovanější – větší průměr prstence •→ změření druhé mocniny průměrů prstenců – vynesení kalibrační křivky a odečet koncentrace neznámého vzorku- •využití: •· ke kvantitativnímu stanovení Ag •· klinická praxe: stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze • jamky - vzorky: -gel s Ab * fyziologický roztok –blank * vzorky o neznámé koncentraci * vzorky o známé koncentraci (kalibrační) •dvojitá imunodifúze •- gelem difundují obě složky •- koncentrace Ag a Ab musí být vzájemně ekvivalentní – proti překrývání linií •Dvojitá jednorozměrná imunodifúze •- ve zkumavce agarózový gel s Ab a agarózový gel s Ag •- mezi nimi čistý gel – v místě vyrovnání koncentrací se vytvoří precipitační linie- •využití: · kvalitativní důkaz Ag •· určení imunochemické příbuznosti či odlišnosti Ag • • Imunodifúze •Dvojitá radiální imunodifúze ~dle OUCHTERLONYHO •na skleněné desky nanesen čistý gel •menší jamky – různé Ag či různé koncentrace jednoho Ag •větší prostřední jamka – Ab •koncentrovanější Ag → precipitační obloučky blíže jamky s Ab •inkubace ve vlhké komůrce •počet precipitačních linií odpovídá počtu odpovídajících si párů Ag a Ab •Využití –průkaz Ab při alergickcýh alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii Imunodifúze Imunodifúze • • •- využití: •· titrace Ag – koncentrace Ag určuje umístění precipitační linie •· důkaz přítomnosti Ab •· porovnávání identity a neidentity Ag směsí ® umístění precipitační linie Ag porovnání Mr (Ag) a Mr (Ab) ® určuje tvar precipitační linie - menší molekula se dostane dále do gelu Imunoelektroforetické metody -kombinace metod elektroforetických a imunodifúzních -Bílkoviny se dělí v závislosti na molekulové váze a elektrické náboji jednotlivých molekul. Při běžné elfo se sérum dělí na zónu albuminu, α – 1, α – 2, β, γ globulinů. Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít význam při hodnocení stádia zánětlivého procesu. Při akutních zánětech stoupá zastoupení α – 1, později i α – 2, při chronickcých zánětech dochází ke zvýšení zastoupení γ globulinů a poklesu albuminu. •imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA •RAKETOVÁ imunoelektroforéza •PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza •DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza •Př. imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: •- 1953 Williams a Grabar •- 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) • vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně •po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici ® dochází k DIFUZI •® v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky • WG2 WG1 WG3 Aglutinační metody •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát -korpuskulární- -princip : KORPUSKULÁRNÍ / částicový / Ag •při reakci dochází ke shlukování Ag a Ab na základě vytváření můstků - Ab mezi buňkami za vzniku shluků •přímá – použití bakterií, buněk •nepřímá, pasivní – na jejich povrch je Ag uměle navázán, př.latex-fixační test, HIT •Předpoklady ke vzniku vazeb: •1. dostatek Ab, 2. přítomnost Ab proti různým epitopům 3. vzdálenost mezi částicemi co největší 4. Ab funkčně jednovazebné nevytváří aglutinaci (IgA, IgE) – inkompletní Ab viz hemaglutinace • •- hodnocení: kvalitativně - odečtení okem • kvantitativně : a, zjištěním množství aglutinátu •b, zjištěním množství Ag v aglutinátu či supernatantu Aglutinace •využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1.K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2.K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu, paratyfu, Weil-Felixova – skvrnitého tyfu, Ab proti Francisella tularensis 3.K Průkazu Treponema p., EBV - mononukleóza 3.Nepřímá - k průkazu auto Ab proti štítné žláze, Ab proti autoAg – • •Latexová aglutinace, latex-fixační test •rychlé kvalitativní stanovení •Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách •Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor •Průkaz patogenních Antigenů (Helicobacter pylori, Adeno- a Rotavirus) • • • • Hemaglutinační •Ag + Ab ® Ag-Ab •hemaglutinogen hemaglutin hemaglutinát •- savčí krvinky (i části) •- dochází ke shlukování krvinek, vlivem komplementu či virové částice pak dochází k LYZI. • •Ke zviditelnění aglutinačních reakcí při použití inkompletních Ab je možno použít a) aglutinaci v bílkovinném prostředí b) v prostředí s proteolytickými enzymy c) použitím antiglobulinového Coombsova séra - králičí ab proti lidským Ig Hemaglutinace -využití: K zjišťování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům. Přímý Coombsův test – k průkazu navázaných antierytrocytárních Ab, reakce pacientových ery s Coombsovým antisérem, přítomnost navázaných Ab se projeví hemaglutinátem -Nepřímý Coombsův test – k průkazu cirkulujících antierytrocytárních Ab -1. fáze, pacinetovo sérum s ery od dárce, navázání Ab pokud jsou přítomny, vymytí, přidání Coomsova séra, které způsobí aglutinaci •při 2 reakcích: •* KFR – komlement fixační reakce •* HIT – hemaglutinačně inhibiční test : • • HIT • •Patří také mezi metody serologické, založené na inhibici biologických účinků antigenů • HIT – pasivní hemaglutinace •Vycházíme ze skutečnosti, že viry (některé bakterie atd) mají schopnost se spontánně absorbovat na červené krvinky (rozpustný Ag). Ery pak aglutinují – shlukují se jen v přítomnosti specifické Ab •· odpovídá-li protilátka Ag, po přidání obalených ERY Ag se Ag vyváže a vznikne HEMAGLUTINÁT •Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát, proběhne hemaglutinace • •· • HIT •neodpovídá-li protilátka virovému Ag, nedojde k hemaglutinaci •situace, kdy přidáme stejný Ag do reakce • Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát + stejný Ag ® Ag -Ab + Ag - Ery ® inhibice hemaglutinace •Metodou inhibice pasivní hemaglutinace lze dokázat velmi malé mn. rozpustného Ag nebo H (metoda je velmi citlivá) •pro vyhodnocení můžeme použít i optické metody •Využití: Průkaz Ab proti patogen. Ag jako Candida Albicans, Aspergillus fumigatus, Treponema pallidum •