Základy interpretace výsledků imunologických laboratorních testů ØVyšetření imunoglobulinů •O hladině Ig nás velmi zhruba informuje procentuální zastoupení gamafrakce při elektroforéze bílkovin, jedná se však o vyšetření velmi hrubé, které odhalí pouze výrazné změny ve smyslu plus nebo minus. Elektroforéza séra je výhodným screeningovým vyšetřením ke zjištění možného paraproteinu. • •Pro vyšetření hladiny imunoglobulinů třídy IgG, IgA, IgM se používá radiální imunodifuze, častěji turbidimetrie nebo spíše nefelometrie. Referenční „normální“ hladiny se liší podle laboratoře, v níž je měření prováděno. Ø ØZvýšení hladin Ig můžeme najít: •Při subakutních a chronických zánětlivých procesech, zejména infekčního nebo revmatického původu. Ø Øzvýšení IgA: •při zánětech převážně slizničního charakteru •při jaterních cirhózách Ø Øzvýšení IgG: •záněty intersticiální Ø ØOsamocené zvýšení IgM při normálních hladinách jiných isotypů •jako odraz proběhlého nebo subakutního zánětu je poměrně řídké Ø ØHladina IgE Øse zjišťuje nejčastěji ELISA technikami. ØZvýšení IgE •doprovází alergické stavy prvého (atopického)typu přecitlivělosti, parazitární choroby •jiné onemocnění (imunodeficitní, autoimunitní a další) ØNormální hodnota IgE nevylučuje možnost alergického postižení ØIzolované zvýšení hladiny jedné třídy Ig: • při myelomu, • monoklonálních gamapatiích •u pacientů ve vyšších věkových skupinách, neboť hladiny Ig, zejména IgA, mají tendenci se zvyšovat s věkem ØSnížení hladin jedné nebo více tříd imunoglobulinů může být způsobeno: Øporuchou tvorby Ig při primárních protilátkových nebo kombinovaných imunodeficitech. Ø Ø Øsekundární poruchou tvorby protilátek, nejčastěji při lymfomech nebo leukémiích Øztrátami Ig močí, stolicí nebo rozsáhlými secernujícími plochami ØHladina IgE Øse zjišťuje nejčastěji ELISA technikami. ØZvýšení IgE •doprovází alergické stavy prvého (atopického)typu přecitlivělosti •parazitární choroby •jiné onemocnění (imunodeficitní, autoimunitní a další) ØNormální hodnota IgE nevylučuje možnost alergického postižení ØSnížení hladiny IgE •nemá podle současných znalostí žádnou diagnostickou hodnotu •Hladiny igE jsou výrazně závislé na věku Øudávají se v mezin. jednotkách (I IU=2,4ng IgE). Pro dospělou populaci se za normální považuje pod 150 IU/ml ØHladinu specifického IgE (tj IgE namířeného proti konkrétnímu alergenu) je nutno zjišťovat velmi citlivými metodikami,nejčastěji ELISA nebo RIA. ØVyšetření je indikováno zejména v případech, kdy u pacienta není možno provézt kožní testy časné přecitlivělosti •při kožním ekzému •příliš nízkém věku pacienta •nebezpečí závažné anafylaktické reakce u silně senzibilizovaného pacienta. ØVyšetření hladiny IgD nemá s výjimkou podezření na IgD myelomu téměř žádnou diagnostickou hodnotu. Ø ØKvalitativní změny Ig: Ø velký význam má průkaz paraproteinu. Øpodezření na přítomnost paraproteinu je možno vyslovit již při elektroforetickém vyšetření séra Ø Ødalší laboratorních vyšetření: §neobjasnitelná vysoká sedimentace erytrocytů pacienta §vysoká hladina jediné třídy Ig při normálních nebo snížených hladinách ostatních tříd ØPro stanovení diagnózy myelomu je nutné provézt další laboratorní vyšetření: ØSternální punkce: §nachází se zvýšený počet plazmatických buněk, často abnormální morfologie (myelomové buňky) §imunologické vyšetření většinou prokazuje zvýšenou hladinu té třídy Ig, v níž je přítomen paraprotein, zatímco u jiných tříd nacházíme imunoparézu – snížení hladin dané útlakem kostní dřeně §v krvi je přítomna anémie, někdy i leukopenie a trombocytopenie §v séru můžeme nalézt hyperkalcémii §zvýšenou hladinu beta – 2 mikroglobulinu §na RTG skeletu, zejm. plochých kostí nacházíme ostře ohraničená osteolytická ložiska. ØKryoglobuliny ØMají schopnost se při teplotách nižších než je teplota těla srážet. ØMnohé kryoglobulinémie jsou klinicky němé, Øněkteré z nich však mohou vyvolávat závažné klinické obtíže: §poškození funkce ledvin §vaskulitidu §chladovou kopřivku Ø Kryoglobulinémie často doprovázejí další imunopatologické stavy: §paraproteinémie §autoimunitní choroby §chronická hepatitida C ØPři vyšetření přítomnosti kryoglobulinu je nutno zajistit takový transport krve, aby teplota neklesla pod 37˚C Ønebo lépe krev odebrat přímo na ambulanci imunologického oddělení. Vyšetření komplementového systému ØZvýšení hladin jednotlivých složek k. systému (C3 a C4) ØMůže být odrazem zánětlivé aktivity ØSnížení hladin složek §způsobeno vrozenou poruchou tvorby jednotlivých složek (např. u C4 jsou heterozygotní deficity velmi časté) §zvýšenou spotřebou k.s. při aktivaci komplexy Ag-Ab (akutní stádium systémových imunokomplexových vaskulitid) ØHladinu C3, C4 a případně jiných složek k.s. se vyšetřují jednoduchou radiální imunodifuzí, turbidimetricky a nefelometricky. ØPokud je u pacienta podezření na defekt některé složky klasické cesty aktivace k.s., provádí se test CH50 Øpři podezření na defekt alternativní složky lze provézt vyšetření AH50 ØPři vyšetření nemocného na podezření na hereditární angioedém Ø(vrozený nebo získaný deficit inhibitoru C1 složky komplementu- C1- INH) §se vyšetřuje koncentrace C1 – INH v séru §funkční test aktivity tohoto inhibitoru. Ø Proteiny „akutní fáze“ se provádí jednoduchou radiální difuzí, turbidimetricky nebo nefelometricky Nejčastěji se sleduje hladina C – reaktivního proteinu (CRP) zjišťování hladin jiných proteinů a.f. jako alfa – 1 – antitripsinu, orosomukoidu, ceruloplasminu, sérového amyloidu A a dalších má již menší význam. Normálně je hladina CRP velmi nízká (pod 10mg/l), při zánětech stoupá až do hodnot stovek mg/l ØHladinu CRP více zvyšují Øzáněty bakteriální než virové. Se zvýšením CRP se setkáváme i při §záněty neinfekčního charakteru §při infarktu myokardu §v pooperačním období §U revmatických chorob: např. v akutní fázi revmatoidní artritidy jsou vždy hladiny CRP výrazně zvýšeny, na druhé straně u systémový lupus erythematodes nacházíme pouze minimální zvýšení CRP. Øsnížení hladin těchto složek může vést k různým chorobám. ØNejznámější je deficit alfa – 1 – antitripsinu §vede ke vzniku plicního emfyzému §k postižení jater ØNízkou hladinu ceruloplasminu nacházíme u Wilsonovy choroby projevující se jaterními a neurologickými příznaky způsobenými depozicí mědi v tkáních. Vyšetření autoprotilátek §Průkaz přítomnosti autoprotilátek - vysoká hodnota při diagnostice autoimunitních chorob § v současné době se jedná o jistě stovky různých popsaných autoprotilátek, které je možno vyšetřovat §přesto bývá sortiment vyšetřovaných protilátek prováděný většinou laboratoří úzký §Důvody: §obtížnost průkazu některých autoprotilátek §nízká výpovědní hodnota prokázané autoprotilátky §některé autoprotilátky mohou mít velkou diagnostickou hodnotu, přesto nejsou příčinou vzniku konkrétního autoimunitního onemocnění §mnohé autoimunitní choroby způsobeny autorektivními T – lymfocyty (těžké prokazovat) a přítomnost autoprotilátek bývá pouze doprovázejícím epifenoménem ØNapř. u Hashimovy tyreoiditidy §nacházíme při laboratorním vyšetření protilátky proti tyreoglobulinu nebo mikrozomům štítné žlázy. Revmatoidní faktor Øje autoprotilátka namířená proti konstantní části molekuly IgG. Ø prokazován nepřímou aglutinací (latex-fixační test) nebo ELISA metodikami. ØJe diagnostickým znakem ukazujícím na onemocnění revmatoidní artritidou. (Asi 20% nemocných s klinicky zřejmou revmatoidní artritidou nemá s revmatoidním faktor prokazatelný; pak se mluví o séronegativní revmatoidní artritidě). ØDalší revmatické choroby: Øsystémový lupus erythematodes, Sjögrenův syndrom Øjiná onemocnění: Øchronické hepatitidy, subakutní bakteriální endokarditidy a další. ØS nízkými titry revmatoidního faktoru se můžeme setkat u starších osob, ačkoli tito lidé netrpí žádnou z uvedených chorob. Antinukleární protilátky (ANA, starší název ANF) Øse vyšetřují nepřímou imunofluorescencí. Ø ØSubstrát pro vyšetření: Øbuňky tkáňových linií Øřezy živočišnými tkáněmi, (krysí játra). ØNález antinukleárních protilátek je důležitý diagnostický text pro: §systémový lupus erythematodes (SLE) §u nemocných s některými jinými revmatickými chorobami (revmatoidní artritida, sklerodermie, Sjögrenův syndrom), §pacientů s chronickou autoimunitní hepatitidou a dalšími onemocněními. §u zdravých, zejména starších lidí - nízké titry ANA ØPodle obrazu při imunofluorescenci můžeme odlišit několik typů antinuklaárních Ab Øhomogenní, granulovaný, periferní a nukleolární Øjednotlivé typy mají vazbu k určitým chorobám. Je též možno blíže specifikovat, proti kterým Ag jádra jsou protilátky namířeny –průkaz: §proti dvouvláknové (nativní) DNA, §histonům §extrahovatelným nekleárním Ag (ENA) sem se řadí antigeny označované jako Ro, La, Sm, Jo a další. ØTato bližší specifikace ANA opět umožňuje přesnější stanovení diagnózy. ØAntimitochondriální Ab jsou ukazatelem primární biliární cirhózy, u jiných chorob nebo u zdravých lidí se vyskytují zřídka, Øvyšetření nepřímou imunofluorescencí na řezech zvířecími ledvinami, jejich přítomnost se projeví fluorescencí ledvinných kanálků. Ø ØProtilátky proti antigenům štítné žlázy - proti tyreoglobulinu a mikrozomální peroxidáze se vyskytují zejména u nemocných s Hashimotovou tyreoiditidou, méně často u jiných postižení štítné žlázy vazbou na receptory pro TSH (tyreotropní hormon) je příčinou Graves- Basedowovy choroby používají se RIA testy. ØProtilátky proti hladkému svalstvu se vyskytují: §u nemocných s chronickou autoimunitní hepatitidou, §při akutních hepatitidách §u zdravých lidí Ø ØProtilátky proti bazální membráně glomerulů glomerulonefritida, zejména rychle progredující forma. ØProtilátky proti acetylcholinovému receptoru neuromuskulární ploténky myastenia gravis ØJejich průkaz je obtížný, metodiky RIA. Pro stanovení diagnózy m.g. není jejich průkaz většinou nutný. Øprotilátky proti cytoplazmě granulocytů (ANCA) Ødiagnostikým znakem pro Wegenerovu granulomatózu Ø Typy ANCA § §c – ANCA (cytoplazmatická ANCA, protilátky proti granulocytární proteináze 3), nález je pro Wegenerovu granulomatózu poměrně specifický § §p – ANCA (perinukleární ANCA, protilátky proti leukocytární myeloperoxidáze) Øvyskytují se: Ø u rychle progredující glomerulonefritidy Øu některých typů systémových vaskulitid (polyarteritid nodosa, Churgův – Straussův syndrom) § §x- ANCA, která bývá pozitivní u nemocných s colitis ulcerosa ØAb proti retikulinu a endomysiu hladkého svalstva Øu nemocných s celiakií Øs kožní chorobou dermatitis herpetiformis (Dühring) Ø ØPři těchto onemocnění má význam i stanovení třídy, v níž je uvedená autoprotilátky, přítomnost IgA protilátek svědčí o aktivitě zmíněných chorob. ØV období remise autoprotilátky třídy AgA postupně mizí, zatímco IgG autoprotilátky přetrvávají velmi dlouho po vymizení příznaků, někdy až celý život. ØObdobný diagnostický význam má i vyšetření Ab proti gliadinu, což je jedna z frakcí bílkoviny obliných zrn – lepku (glutenu) ØAb proti erytrocytům se vyšetřují přímým a nepřímým Coombsovým testem, indikací je podezření na hemolytickou anémii ØDalší vyšetření: Øchladové aglutininy a chladové hemolyziny, jež vyvolávají aglutinaci a hemolýzu v závislosti na teplotě, při níž reakce probíhá. Ø ØAntitrombocytární Ab Øu některých nemocných s autoimunitní idiopatickou trombocytopenickou purpurou Ø Protilátky proti granulocytům Øautoimunitní granulocytopenie ØVyšetření:provádí se na hematologických nebo transfúzních odděleních. Ø protilátky proti parietálním buňkám žaludku Ø u atrofické gastritidy a perniciózní anemie Øprotilátky proti beta buňkám pankreatu Øu diabetes mellitus, inzulin – dependentní diabetes, DM-1 není ve srovnání s metodikami biochemickými diagnosticky příliš přínosné. Ø protilátky proti nadledvinkám Øu autoimunitní adrenalitidy Øpříčně pruhovanému svalstvu a mnoha dalším tkáním nebo orgánům. Klinický přínos těchto vyšetření je v současné době omezený, stále však probíhá intenzivní výzkum, snažící se nalézt diagnosticky cenné autoprotilátky, Vyšetření cirkulujících IK ØMá většinou význam pouze při monitorování zánětlivého procesu Øzvýšení §v subakutním, §chronickém či §rekonvalescentním stadiu různých zánětlivých procesů §Význam pro diagnózu imunokomplexových chorob je velmi omezený, u nemocných s těmito chorobami je možno nalézt poměrně často normální hladiny IK §Pro diagnózu imunokomplexového postižení je mnohem důležitější průkaz deponovaných IK v postižených tkáních pomocí přímé imunofluorescence význam: §pomohly by v laboratorní diagnostice autoimunitních chorob, §stanovily by pravděpodobnou závažnost postižení, prognózu či pravděpodobnou odpověď na léčbu.