Protokol Příprava roztěru hemolymfy Teorie: Pozorování buněk hemocytů, hemolymfa u bezobratlých Cíl: připravit roztěr z jednoho zástupce hmyzu (Zavíječ voskový nebo Bourec morušový) ke sledování hemocytů u hmyzu. Materiál: Larvy bource nebo zavíječe, kyvety na barvení, barvící souprava Leukodif (Biolatest) nebo barvící roztoky na barvení podle Pappenheima (roztok May - Grünwald v poměru 1:1 s vodou, Giemsa barvivo v poměru 1:9 s destilovanou vodou, metylalkohol), podložní skla, rukavice, alkohol na čištění skel, nastavitelné mikropipety, špičky, oční nůžky, teplotní vodní lázeň Postup práce: Ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme, např. na topení. Buňky lépe přilnou ke sklu. Roztěr: blod-smear3 Roztěry pushed_fims 1. příliš tenký a dlouhý 2. dobrý 3. příliš krátký, kapka krve byla moc malá 4. příliš silný, kapka krve byla moc velká Převzato z http://www.aum.iawf.unibe.ch/hemosurf/Demo_E/Lab/smears_quality.htm Barvení podle Pappenheima v kyvetách: 3 min. fixace v kyvetě s metylalkoholem 3 min. May - Grunwald 1:1 s vodou (lépe 2 min.) 15 min. Giemsa - Romanowski 1:9 s vodou opláchnout ve vodě, nechat schnout pozn. sklíčka vkládat rubem k sobě do 1 drážky Barvení soupravou Leukodif 200 ponořit 5x1s do fixačního roztoku č. 1 (metanol), otřít kapky o stěnu nádobky ponořit 3x1s do činidla č.2 (barvivo Eosin), otřít kapky o stěnu nádobky ponořit 5x1s do činidla č. 3 (barvivo Azur), otřít kapky o stěnu nádobky opláchnout v dest.H2O a nechá zaschnout na vzduchu Vyhodnocení: v roztěru z hemolymfy pozorujeme hemocyty a zakreslíme Protokol Sledování fagocytárních schopností hemocytů u larev Bource morušového nebo Zavíječe voskového. Teorie: V hemolymfě se nachází tyto typy hemocytů: prohemocyt, plazmatocyt, granulocyt, eonocytoid, coagulocyt, sferulocyt, adipohemocyt. U Zavíječe fagocytují plazmatocyt a granulocyt, u Bource jen granulocyt. Cílem bude naučit se poznávat hemocyty a pozorovat jejich fagocytární aktivitu. Cíl: Sledování fagocytární aktivity hemocytů, výpočet fagocytárního indexu a % fagocytózy Materiál: Larvy Bource nebo Zavíječe voskového, roztok škrobových zrn, fenylthiomočovina, injekční stříkačka - inzulinka, nůžky, podložní sklíčka, barvící roztoky, eppendorfky, špičky, nastavitelné mikropipety Postup: 1.Ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme (na topení) 2.další kapku - 10 μl přeneseme do eppendorfky obsahující fenylthiomočovinu, aby se hemolymfa nesrazila, přidáme 5 μl roztoku částic škrobu a necháme 20min kultivovat 3.po kultivaci kápneme kapku hemolymfy stejným způsobem na podložní sklíčko a rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme (in vivo způsob) 4.do další larvy injikujeme 20 μl roztoku inertních částic, larvy necháme v teple 20 min kultivovat (larvy při injikaci nenatahovat), (in vitro zp.) 5.po kultivaci částic (škrobu) v larvě ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme 6.roztěry barvíme barvící soustavou Leukodif nebo podle Pappenheima. Výsledek a vyhodnocení: 1. Pozorujeme hemocyty (kreslíme a fotíme aspoň tři druhy) bez fagocytózy a totéž s fagocytózou. 2. Počítáme poměr množství fagocytovaných částic a množství fagocytů a vypočítáme fagocytární index (FI) a % fagocytózy zvlášť u fagocytózy s částicemi škrobu (u in vitro způsobu).. FI = (počet fagocytovaných částic)/(počet fagocytujících buněk) % fagocytózy = (počet fagocytujících buněk)/(celkový počet buněk schopných fagocytózy v daném prostoru) x 100 1. Roztěry hodnotíme pomocí diferenciálního počtu hemocytů, při kterém jako fagocytující označujeme jen ty částice, které pohltily 3 a více partikulí. 2. Vypočítáme fagocytární index FI tak, že dělíme počet fagocytovaných částic počtem fagocytujících buněk. 3. Vypočítáme % fagocytózy tak, že dělíme počet fagocytujících buněk v daném prostoru počtem všech buněk schopných fagocytózy a násobíme 100. Příklad vyhodnocení: plasmatocyt granulocyt neznámý suma 3 3 4 1 5 3 3 4 4 4 1 5 3 3 21 2 (%) 0 (%) 23 Tabulka: počty fagocytujících hemocytů v roztěru hemolymfy hmyzu FI = počet fagocytovaných částic / počet fagocytujících buněk = X %F = počet fagocytujících buněk / počet buněk schopných fagocytózy =x% Schéma pokusu METODA Bez fagocyt. (kontr.) Fagocytóza in vivo, in vitro každý ze dvojice larva sklo kapka → → roztěr, barvení 10 μl hemol s phenylthio + 5 μl (MSHP) → kultivace → → roztěr , barvení larva + 20 μl (škrob) → → kultivace → → roztěr , barvení