Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2012 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 18 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: Přezůvky a plášť, protokoly, svačina, kdo má malý foťák V praktickém cvičení se budeme zabývat testy sledujícími aktivitu IS a) bezobratlých b) obratlovců Metody: Odběr a zpracování krve (krevní diferenciál), hemolymfy; Imunodifúze - Ouchterlonyho modifikace; ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto); Test aktivity lymfocytů; rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; Test ALT (stanovení aktivity jaterního enzymu), Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); Test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (HIT). Termín: 5.2.-8.2. 013 od 8.30hod Konjugát myší a lidský vyzkoušet, je v mražáku 2 polička naproti jídelní ledničky, Příprava Ag ultrazvukem a škrobových zrn Koupit: tubulinky Úterý 8:30 Instruktáž: ke cvičení toho dne 1. Imunodifúze, 2. krevní roztěr a příprava séra 3. příprava destiček na ELISA postupný odběr krve z prstu, ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťování konc. antigenu, ředění Ag, kalibrační křivka a napipetování na destičku; mezitím imunodifúze; v mezičase barvení roztěrů a krevní diferenciál; ruleta na imunochromatický test Pomůcky: ELISA: 6 destiček a dvě už hotové, Ag už sonifikovaný, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozto k, lednička Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test Imunodifúze: pipety, skla na imunodifúzi, vlhké komůrky, nůžky Odběr krve: rukavice, ependorfky, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na ruletu Středa 8:30 Instruktáž: 1. imunochromatografické testy, 2. ALT test, 3. odběr hemolymfy z larev Zavíječe vosko vého, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytárních schopností hemolymfy ELISA-pokračování: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s k aseinem, promytí destiček; v mezičase zpracování krve na sérum, imunochromatografické testy, odběr hemolymfy z larev Zavíječe voskového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytár ních schopností hemolymfy, barvení roztěrů a pozorování pod mikroskopem hemocytů, počítání FI a % F , krevní diferenciál - dokončení Pomůcky: ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, promývačka ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm Fagocytóza: Leukodif, roztok škrobových zrn, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky, stříkačky a jehly Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň, malý termostat Čtvrtek 8:30 Instruktáž: 1. Test aktivity lymfocytů. 2.Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka, v mezičase počítání krevní diferenciál, Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk -dokončení Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk - dokončení Pomůcky: Komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální, lektin anti-H monoklonální; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100 C°, vortex, stojánky na zkumavky, štítky, fixy. Pátek 8:30 Instruktáž: 1. samotná ELISA ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substr. roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO[4], měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO[4], ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Přehled metodik: Odběr a zpracování krve, příprava séra, stanovení krevního diferenciálu Imunodifúze - Ouchterlonyho modifikace ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. Test aktivity lymfocytů, ATP test Test aktivity jaterních buněk, ALT test Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti RSV 5x Rychlý kvalitativní test pro časné potvrzení těhotenství 2x Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti HIV viru 1x Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení 2x Rychlý test ze slin pro odhad hladiny alkoholu v krvi 2x Rychlá imunochromatografická metoda stanovení Chlamydia trachomatis - individuální stanovení 5x Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka (HIT)