Stanovení ALT (Alaninaminotransferáza) v séru člověka


Teorie: Aminotransferázy jsou enzymy usnadňující přeměnu jedné aminokyseliny v jinou. Tím pomáhají
udržovat vyvážený přísun aminokyselinových jednotek potřebných pro syntézu bílkovin. Zvýšená
aktivita alaninaminotransferázy je významným indikátorem nemocí jater.

V praxi jsou transaminázy látky tělu vlastní, které se obvykle nacházejí v buňkách. Po jejich
rozpadu přecházejí do krevního séra. ALT transamináza je obsažena převážně v buňkách jater, srdce,
kosterních svalů, ledvin, mozku a v červených krvinkách. Zvýšená hodnota ALT znamená tedy zvýšený
rozpad buněk v těchto oblastech.

Norma: 0,06 – 0,14 ukat/l

Hraniční hodnota: 0,42 ukat/l


Úkol: Stanovit ALT v séru člověka

Pomůcky: stojánek na eppenndorfky

                   nastavitelné pipety

                   termolázeň  na 37^oC

                   ELISA-reader s filtrem o vlnové délce 500-530 nm


Princip metody: alaninaminotransferáza (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa E.C.2.6.1.2)
katalyzuje reakci mezi L-alaninem a 2-oxoglutarátem, které převádí na L-glutamát a pyrohroznan,
Stanovení je založeno na měření absorbance hydrazonů kysein 2-oxoglutarové a pyrohroznové
v alkalickém  prostředí. Hydrazon kyseliny pyrohroznové má vyšší absorbanci.


L-alanin + oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát

Pyruvát + NADH + H^+ ® laktát + NAD^+

Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance při 340 nm.


Činidla

1. Enzym: NADH

LD ³ 2,5 mkat

NADH ³ 21,6 mmol/lahvičku


2. Startér

2-oxoglutarát 180 mmol/l

Azid sodný 0,1 %


3. Pufr – substrát

Tris 120 mmol/l

L-alanin 800 mmol/l

Azid sodný 0,1 %


4. Aktivátor

Pyridoxal-5-fosfát 6 mmol/tabletu


Složení inkubační směsi

Trisový pufr, pH 7,2 (37 °C): 100 mmol/l

L-alanin: 660 mmol/l

Laktátdehydrogenáza (LD): ³ 25 mkat/l

NADH: ³ 180 mmol/l

2-oxoglutarát: 15 mmol/l

Pyridoxal-5-fosfát: 100 mmol/l

Objemový poměr sérum/inkubační směs: 1/12


Kalibrace

BIO-LA-TEST LYONORM KALIBRÁTOR, kat. č. 10003200 (1,36 mkat/l)


Příprava procovního roztoku

Obsah lahvičky s činidlem 1 se rozpustí ve 100 ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění se přidají 2
tablety činidla 4.


Postup analýzy

Vzorky: nehemolytické sérum, heparinizovaná nebo EDTA plazma

Vlnová délka: 340 nm

Kyveta: 1 cm

Teplota: 37 °C





pracovní roztok

               100 ml


sérum

               10 ml


promíchá se a inkubuje 10 minut při 37 °C a přidá se:

činidlo 2

               10 ml



Promíchá se, inkubuje se 2 minuty při 37 °C a měří se absorbance v 1 minutových intervalech nejméně
po dobu 3 minut. Vypočte se průměrná změna absorbance za 1 min (DA).


Výpočet

ALT (mkat/l)= (DA) x 31,7