Stanovení ALT (Alaninaminotransferáza) v séru člověka Teorie: Aminotransferázy jsou enzymy usnadňující přeměnu jedné aminokyseliny v jinou. Tím pomáhají udržovat vyvážený přísun aminokyselinových jednotek potřebných pro syntézu bílkovin. Zvýšená aktivita alaninaminotransferázy je významným indikátorem nemocí jater. V praxi jsou transaminázy látky tělu vlastní, které se obvykle nacházejí v buňkách. Po jejich rozpadu přecházejí do krevního séra. ALT transamináza je obsažena převážně v buňkách jater, srdce, kosterních svalů, ledvin, mozku a v červených krvinkách. Zvýšená hodnota ALT znamená tedy zvýšený rozpad buněk v těchto oblastech. Norma: 0,06 – 0,14 ukat/l Hraniční hodnota: 0,42 ukat/l Úkol: Stanovit ALT v séru člověka Pomůcky: stojánek na eppenndorfky nastavitelné pipety termolázeň na 37^oC ELISA-reader s filtrem o vlnové délce 500-530 nm Princip metody: alaninaminotransferáza (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa E.C.2.6.1.2) katalyzuje reakci mezi L-alaninem a 2-oxoglutarátem, které převádí na L-glutamát a pyrohroznan, Stanovení je založeno na měření absorbance hydrazonů kysein 2-oxoglutarové a pyrohroznové v alkalickém prostředí. Hydrazon kyseliny pyrohroznové má vyšší absorbanci. L-alanin + oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát Pyruvát + NADH + H^+ ® laktát + NAD^+ Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance při 340 nm. Činidla 1. Enzym: NADH LD ³ 2,5 mkat NADH ³ 21,6 mmol/lahvičku 2. Startér 2-oxoglutarát 180 mmol/l Azid sodný 0,1 % 3. Pufr – substrát Tris 120 mmol/l L-alanin 800 mmol/l Azid sodný 0,1 % 4. Aktivátor Pyridoxal-5-fosfát 6 mmol/tabletu Složení inkubační směsi Trisový pufr, pH 7,2 (37 °C): 100 mmol/l L-alanin: 660 mmol/l Laktátdehydrogenáza (LD): ³ 25 mkat/l NADH: ³ 180 mmol/l 2-oxoglutarát: 15 mmol/l Pyridoxal-5-fosfát: 100 mmol/l Objemový poměr sérum/inkubační směs: 1/12 Kalibrace BIO-LA-TEST LYONORM KALIBRÁTOR, kat. č. 10003200 (1,36 mkat/l) Příprava procovního roztoku Obsah lahvičky s činidlem 1 se rozpustí ve 100 ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění se přidají 2 tablety činidla 4. Postup analýzy Vzorky: nehemolytické sérum, heparinizovaná nebo EDTA plazma Vlnová délka: 340 nm Kyveta: 1 cm Teplota: 37 °C pracovní roztok 100 ml sérum 10 ml promíchá se a inkubuje 10 minut při 37 °C a přidá se: činidlo 2 10 ml Promíchá se, inkubuje se 2 minuty při 37 °C a měří se absorbance v 1 minutových intervalech nejméně po dobu 3 minut. Vypočte se průměrná změna absorbance za 1 min (DA). Výpočet ALT (mkat/l)= (DA) x 31,7