Lecture 10: Wnt morphogenetic system Wnts (Wingless/Int) - family of ligands - 19 members in human and mouse - glycosylated and palmitoylated extracellular proteins - short range of action, bind to extracellular matrix - only in multicellular animals canonical (eg. Wnt-1 or Wnt-3a) non-canonical (eg. Wnt-5a) Wnt/b-kateninová dráha (= kanonická dráha) - induce axis duplication in Xenopus - induce transformation of mammary cell line C57mg -signal via nuclear translocation of b-catenin - 29836_1_two_mind_tadpole_BIL110809 Wnt/b-catenin pathway Wnt secretion Purification of Wnt ligands Wnt-3a no detergent detergent added Frizzled – crucial receptor of most (all?) Wnt pathways Lrp5/6 – crucial co-receptor of the canonical Wnt pathway Destruction complex •A working model for the destruction complex. (1) Initially, the destruction complex contains Axin, GSK3, CK1 and APC (with the 15 aa and 20 aa repeat regions shown). The complex contains other components such as PP2A, which are not shown here. (2) -Catenin enters the complex by binding Axin and potentially the APC 15 aa repeats. This positions the N-terminus of -catenin near CK1 and GSK3. (3) CK1 phosphorylates -catenin at Ser45. (4) GSK3 phosphorylates -catenin at, successively, Thr41, Ser37 and Ser33. (5) The 20 aa repeats, particularly repeat 3, are phosphorylated by a CK1 (and possibly GSK3) which greatly increases their affinity for -catenin. The binding of a phosphorylated 20 aa repeat to -catenin displaces Axin from -catenin. (6) -TRCP1 binds the phosphorylated N-terminus of -catenin, causing the ubiquitination of -catenin by an E2 ligase. APC is then either desphosphorylated within the complex, allowing the ubiquitinated -catenin to leave the complex, or the ubiquitinated -catenin bound to APC leaves the complex and is separated from APC at the proteasome. The complex then returns to Step 1 destruction complex 9_wnt Tyr142 of b-catenin: phosphorylated – binds Bcl9 dephosphorylated – binds a-catenin Epithelio-mesenchymal transition (EMT) Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Maternální Wnt/b-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya maternal Wnt in Xenopus xenopus_gastrulation_2 frogs Wnt/b-cateninová dráha určuje anterioro-posteriorní (AP, předo-zadní) osu těla během gastrulace – podporuje vznik zadních a blokuje vznik předních částí těla maternal Wnt in Xenopus Uncx4 myší embryo po gastrulaci (E8.5): Cílové geny Wnt/b-cateninové dráhy jsou exprimovány v zadní části těla. Deplece Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout Wnt/b-cateninová dráha je klíčovým regulátorem aktivace kmenových buněk jak v embryogenezi, tak v dospělých tkáních Wnt/b-catenin dráha je velmi často deregulovaná u nádorů! according to Beachy et al., Nature 2004 Reya & Clevers 2005, Nature The effects of Wnts on stem cells in their niche Wnt Lo Celso, C. L. et al. Development 2004;131:1787-1799 Důsledky aktivace b-cateninu v epidermis (po depilaci) Wnt pathway induces de novo formation of hair follicles Wnt signaling pathway related polymorphism? Aktivace b-cateninu ve vyvíjející se mozkové trubici: Chenn & Walsh, 2002: Science;297:365-369. Zechner et al., 2003: Dev. Biol.;258:406-418. midbrain (Brn4-promotor) cortex (nestin enhancer) Järvinenet al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 18627-18632 Aktivace beta-cateninu v kmenových buňkách zubu: Wnt/b-cateninová dráha reguluje vývoj neurální lišty (neural crest) Nervová lišta (neural crest) -populace buněk, vzniká z dorsální (= horní) strany nervové trubice procesem delaminace a migruje několika hlavními cestami do jiných částí embrya neural crest Co všechno z NC vzniká? •1. Oblast trupu: co z ní vzniká 2 • Neurony a gliální buňky senzorického, sympatického a parasympatického systému • Buňky dřeně nadledvin • Pigmentové buňky epidermis • Svalové buňky některých cév - podíl na vzniku cca 40 různých tkání a orgánů I. Vývoj neurální lišty: - neurální lišta je zdrojem periferního nervového systému, melanocytů, obličejových kostí a svalů, částí srdce a dalších Wnt3a in NC Wnt-3a buňky NL kuřecí lebka buňky NL člověk Hari, L. et al. J. Cell Biol. 2002;159:867-880 Wnt signaling při vývoji neurální lišty Wnt/b-cateninová dráha v regulaci stárnutí Klotho myš -mutantní kmen myši s fenotypem akcelerovaného stárnutí: např. kratší život, arterioskleróza, snížená plodnost nebo kožní atrofie - protein Klotho je transmembránový protein s velkou extracelulární doménou, ta může být odštěpena a volně cirkulovat v krvi aktivita Wnt/b-cateninové dráhy ve střevním epitelu Model 1 – svalová fibróza - s prodlužujícím se věkem stále častěji při regeneraci svalu vznikají místo svalových buněk buňky fibrózní tkáně – tak přispívají k nižší výkonnosti svalu, která souvisí se stárnutím Model 2 – parabiotické párování Fyzické propojení dvou krevních systémů (a tím i dvou vnitřních prostředí) u myši dbmouse Nekanonická Wnt dráha - e.g. Wnt5a - do not induce axis duplication in Xenopus - do not induce transformation of mammary cell line C57mg - do not signal via nuclear translocation of b-catenin - frogs-gastrulation Drosophila – PCP (planar cell polarity) PCP scheme drosophila wing Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Defect in the non-canonical Wnt pathway in mammals Changes in the "haircut" ridgeback Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) pathway: phenotypes in mouse Stereocilia orientation in inner ear hair cells Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. inner_ear_hair_cells ear%20cutout •struktura 9+2 •pohyblivé •epitely tracheje, vejcovodů, ependym… • • Primary cilia vs. motile (secondary) cilia nstruktura 9+0 nnepohyblivé ntéměř všechny buňky (www.primary–cilium.co.uk) nsolitérní n fig006rsc 505px-Eukaryotic_cilium_diagram_en_svg ror2 RRS BDB 1740-1774del35 N620K W720X C182X R184C R189W R205X R366W R396X Q502X 1321-1325del(5) IVS8+3+5del3ins19 1398-1399insA W749X 2249delG Y755X Q760X Mutations in Ror2 cause dominant brachydactyly type B (BDB) and recessive robinow syndrome (RRS) Provided by S. Stricker Ror2 Known Wnt5a knockout phenotypes E 18.5 +/+ -/- Yamaguchi et al., 1999 Qian et al, 2007 Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) in mouse (and human) convergent extension exencephaly Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencephaly Hamblet et al., 2002, Development Open neural tube Možnosti studia CE - Kellerovy explantáty (Xenopus) CE control XLRP5 MO Lrp5/6 loading control XLRP5 MO + mLrp5 Wnt-induced assymetry W-RAMP = Wnt-mediated receptor-actin-myosin polarity Možnosti studia migrace – Transwell assays (mammalian cells) transwell chamber transwell corning Attractant Možnosti studia migrace – attractant/repelent assays Attractant/repelent Wnt repulsion Wnt Repulsion 2