METODY STUDIA



Sekvence DNA – chemická (selektivní štěpení – Maxam-Gilbert), biochemická (syntéza, dideoxy metoda
- Sanger)















PCR



Taq polymeráza, dNTP, primery, vzorek-templát


Termocycler - animace


Potřeba primerů



Kvantitativní PCR


Význam – analytický – diagnostika, forenzní analýza,

-         preparativní  - pomnožení materiálů, umělé geny atd.







RT-PCR

































Syntéza oligonukleotidů






Cyklický proces – automatizace

Syntéza na pevné fázi









Komerčně dostupné oligonukleotidy – primery            Vlastní primery


Syntetizované geny



                           Table 12.3

                           Some Chemically Synthesized Genes

                           Gene

                                                               Size (bp)

                           tRNA

                                                               126

                           α-Interferon

                                                               542

                           Secretin

                                                               81

                           γ-Interferon

                                                               453

                           Rhodopsin

                                                               1057

                           Proenkephalin

                                                               77

                           Connective tissue activating
                             peptide III

                                                               280

                           Lysozyme

                                                               385

                           Tissue plasminogen activator

                                                               1610

                           c-Ha-ras

                                                               576

                           RNase T1

                                                               324

                           Cytochrome b [5]

                                                               330

                           Bovine intestinal Ca-binding protein

                                                               298

                           Hirudin

                                                               226

                           RNase A

                                                               375





Delší geny po částech



Komerčně dostupné oligonukleotidy



Cílená (site-directed) mutageneze












GENOVÉ MANIPULACE



Gen se inkorporuje do nosiče – vektoru (analogie se strategií virů) a vnese do hostitelské buňky.


Využití restrikčních endonukleáz (palindromové sekvence) event. reversních transkriptáz (vyřeší
problém intronů)











Vektor, cílový organizmus, manipulace s vlastními geny (pod jiný promotor)