Měření enzymové aktivity ■ optické ■ elektrochemické ■ manometrické ■ vhodné substráty ■ příklady stanovení nejdůležitějších enzymů Měření aktivity • podmínky konstantní (složení pufru, pH, teplota, tlak) • rychlost reakce limituje enzym (ostatní reagencie v nadbytku) • rychlost změny signálu v čase by měla být konstantní (lineární oblast, saturace enzymu substráty, tj. [S] » KMSprotože pak platí "s V,im) Fotometrie optická kyveta intenzita /, / detektor D <------> tloušťka / ln(/0//)= A = £Cl Lambert-Beerův zákon • pokles intenzity (absorbce) světelného paprsku po průchodu kyvetou s barevnou látkou je úměrný koncentraci stanovované látky • v praxi se používá absorbance A, která je přímo úměrná koncentraci c (extinkční koeficient e při dané vlnové délce je konstantou úměrnosti) a velikosti / kyvety • absorbance je bezrozměrná veličina • (rozptyl světla se obvykle zanedbává ) • dA/dt... u přístrojů s kontinuálním záznamem • AA ... změna absorbance při ručním odečtu (AA=Akonec-Apočátek) za dobu i n ku bace Ař • V... objem reakční směsi v kyvetě při měření (celkový, včetně všech přídavků) • /... délka optické dráhy v kyvetě (obvykle 1 cm) • £ ... extinkční koeficient, udává se obvykle při určité vlnové délce (např. e280) pozor na jeho jednotky Výpočet aktivity dn VÍ dA^ VAA a = — = — — dt d\dt J slAt Ukázka záznamu směrnice äAIät , startovací přídavek nastartování reakce, inkubace po dobu Af, zastavení reakce počátek cas • kontinuální a diskontinuální měření absorbance Fluorescence intenzita /„ zdroj světla fluorescence (kolmo na excitační paprsek) l0»lf D detektor je využívána velmi často z důvodu vysoké citlivosti absorbcí energie přechází molekula do excitovaného stavu, návrat do základního stavu je provázen emisí záření - fluorescence intenzita fluorescence /, závisí na absorbanci a kvantovém výtěžku 4> emisní spektrum látky je oproti excitačnímu posunuto k vyšším vlnovým délkám (Stokesův posuv) pro budící záření se často používá světlo laseru, je také výhodné používat polarizované záření vztah mezi fluorescencí a látkovým množstvím substrátu či produktu se určí kalibrací (není extinkční koeficient - podmínky měření málo reprodukovatelné) Luminiscence aktivace rozpad je to emise světla z molekuly v excitovaném stavu, který vznikl jako důsledek chemických reakcí kvantový výtěžek luminiscence odpovídá podílu počtu vyzářených fotonů a excitovaných molekul, u přírodních systémů může dosahovat až 90% intenzita /vyzařovaného světlaje závislá na čase, v určitém okamžiku prochází maximem (tmax) kk ln^ I * [Ao] y^r [exp(-fy) - exp(-£2f) t =_^ K~K k -k • vztah mezi luminiscencí a látkovým množstvím substrátu či produktu se určí kalibrací Měření kyslíku • provádí se elektrochemicky pomocí Clarkova článku • elektrodová redukce kyslíku (-750 mV, katoda) je 4-elektronový proces: Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCI elektroda elektrolyt membrána propustná pro 02 • 02 + 2H20 + 2e- • H2Oz + 2 e- - H2Oz + 2 OH 2 OH Ukázka záznamu • nejprve se provede jednorázová kalibrace sensoru, pak vlastní měření • měřící nádobka uzavřená - aby tam nešel kyslík z okolí Výpočet aktivity dno2 co,o2v dl Cl — —-- dt lsat ~ Kb dt • c002... výchozí koncentrace kyslíku v roztoku za daných podmínek (typ pufru, teplota, tlak) - určí se z tabulek • d//dr... rychlost úbytku proudu v přítomnosti enzymové reakce • lsat - maximální velikost proudu při saturující koncentraci kyslíku • lzb - zbytkový proud sensoru v mediu bez kyslíku (vyčerpá se chemickou reakcí se siřičitanem - kalibrace) • někdy sensor přímo měří koncentraci kyslíku Acidobazické titrace • enzymové reakce zahrnující změnu pH -zejména hydrolasy (štěpení konjugátů poskytuje kyselinu jako jeden z produktů) • oxidace substrátů pomocí NAD+ • vznikající kyselina (>áze) je průběžně titrována standardním roztokem báze (kyseliny) o známé koncentraci tak, aby pH roztoku bylo pořád stejné jako při zahájení reakce - zařízení pH-stat • rychlost "odebírání" ("dodávání") iontů H+ pak určuje aktivitu enzymu Výpočet aktivity • ctitl.... koncentrace standardního roztoku titračního činidla; pozor na stechiometrii, např. cm = [H+] = 2[H2S04] • 6VtitlJ6t... rychlost přítoku titračního činidla do měřící nádobky Princip pH-statu pH elekti nádobka s míchadlem výchozí pH signál = dV^/df mikroprocesor elektronická byreta s titračním činidlem udržování konstantního pH v pracovní nádobce zpětná vazba řídí rychlost přidávání titračního činidla to kompenzuje změny pH vyvolané enzymovou reakcí Ukázka pH statu Manometrické metody měří se objem plynu vyvinutého (nebo spotřebovaného) v enzymové reakci za normálních podmínek (25 °C, 101 kPa) konstanta úměrnosti - molární objem plynu, Vm=22,4 dm3/mol Výpočet aktivity nejsou-li normální podmínky, určí se látkové množství plynného produktu ze stavové rovnice: An = P^V RT NAD(P)+ / NAD(P)H - Wartburgův optický test dehydrogenasa AH, + NAD4 •-• NAD" o......° NADH ^ A + NADH + H+ přirozený substrát, který při enzymové reakci mění barvu (chromogenní) - při 340 nm univerzální pro stanovení dehydrogenas (xDH) často funguje jako koncový krok "zviditelňující" předcházející "nebarevné" enzymové reakce Tetrazoliové soli bezbarvá tetrazoliová sůl barevný formazan umožňuje napojení na reakce produkující NADH - měření probíhá ve viditelné oblasti spektra přenos elektronů z NADH na tetrazolium probíhá pomocí dalšího enzymu diaforasy nebo pomocí mediátoru fenazinmethosulfátu (PMS) NADH NAD+ diaforasa(FAD) diaforasa(FADH formazan tetrazolium 2H+ 2e Peroxid vodíku, peroxidasa • obecná reakce peroxidasy: DH2 + H202 -► D + 2 H20 bezbarvý barevný • široká řada substrátů • ABTS, kyselina 2,2'-azino-bis(ethylbenzothiazolin)-6-sulfonová TMB CH, CH, CH, CH, CH, WCH, \B(11-2S5nm CH. I + :i/2 CH, CH, CHj TH, CH. CH, HN-O—O-NH + 2H + CH,^ WCH, 450 nm CHjW WCH, \Bo»"370,652nfn 3,5,3',5'-tetramethylbenzidin + H + 4-aminoantipyrin Hydrolasy • použití derivátů 4- nebo 2-nitrofenolu a 4-nitroanilidu • po hydrolyse vzniká intenzivní žluté zbarvení • hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např. tetrazolium) přechází na modré indigo Fluorogenní substráty oxidoreduktas /|pO-CH3 Z^O-CH3 1 O ľ"! rhodamin 123 O dihydrorhodamin oxiduje superoxidový radikál na rhodamin 123, zelená fluorescence, Aex / Aem = 505 / 534nm) Fluorogenní substráty hydrolas 0 II HO-P-O^ H20 OH 1 | - if r - H3P04 K XJ MUP i CH3 T CH3 4-methylumbelliferylfosfát (MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, Aex/Aem = 360/450 nm) deriváty 7-amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC nebo Z-X-MCA), AMC produkt Aex / Aem při 342 / 441 nm, např. 7-amino-4-methylkumarin Ař-CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid (Z-FR-AMC) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, Ař-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamid (Z-DEVD-AMC) pro kaspasu 3 alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, např. Z-DEVD-AFC Z-X-NH.^ CH3 A/-CBZ- je A/-benzyloxykarbonyl- Fluorogenní substráty hydrolas OH | OH | 0=pr0^ v°-r° 1 T— OH "^p^^o T 1 OH FDP ^O deriváty resorufinu deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP H H ^ -N-R-Z |£::~o ^^^^__-* M— BZAR rhodamin 110, bis-(W-CBZ-L-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520 nm) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC jiný příklad - rhodamin 110, bis-(Ař-CBZ-L-fenylalanyl-L-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L Srovnání spektrálních vlastností FRET fluorescence energy resonance transfer fluorescenční skupina (fluorofor) ^zhášející skupina (quencher) hydrolysa vhodné skupiny oddálení - není ve spojovacím můstku přenos energie \ na: nezářivý resonanční přenos AMP +PP + oxyluciferín + C02 + h v ■ mořské bakterie (Vibrio fischeři, V. harveyi, Photobact. phosphoreum) luciferasa (EC 1.14.14.3) až 5% obsahu buňky, oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal); v buňce obsahují i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu: NAD(P)H + FMN + H+ NAD H oxidoreduktasa > NAD(P)+ + FMNH2 Luciferasa FMNH2 + R-CHO + 02 -> FMN + R-COOH + H20 + hv ■ měření dehydrogenas Radiometrie • sledování radioaktivně označeného substrátu nebo produktu • používané sloučeniny: - jednoduché - 14C02, 3H20, 35S042 - uniformě značené - [14C] alanin, [14C] ethanol - specificky značené L-[methyl-14C] methionin, [methyl-3H] thymin • jednotky: Bequerel ~ s1 (dle SI), Curie ~ 1 g 226Ra, (|iCi - mCi v praxi) • detektory - ionizační (Geiger-Mullerova trubice) - scintilační - polovodičové skenery - fotografický materiál • separace rad. produktu - precipitací, extrakce - vývoj nebo inkorporace rad. plynu nebo těkavé látky - elektroforesa, papírová nebo tenkovrstevná chromatografie výhody - přesnost, chemická identita, měření radioaktivity nezávisí na formě a podmínkách • problémy - nákladné vybavení i reagencie, pracovní rizika Microarrays • screening enzymů použitím mnoha různých substrátů (array) zakotvených na nosiči Screening kinas HO OH ' |r + protein kinasy fluorescenčně značená protilátka anti-fosfo tyrosine1 anti-fosfoserin ... radioaktivní značení + protein kinasy Průběh reakce - "závady' [P] zpomalování reakce - málo substrátu, vznik rovnováhy - inhibice produktem - nestabilní enzym - inhibice s pomalou rovnováhou - nedokonalá metoda - změněné podmínky stanovení cas reaguje i bez enzymu (či substrátu) - precipitace - usazování částic - kontaminace substrátu enzymem (enzymu substrátem) - neenzymový rozklad substrátu - usazování na stěny reakčních nádob lag fáze / rychlejší počátek - špatná regulace teploty - usazování částic - špatné promíchání - pomalý ustálený stav - pomalá odezva detektoru - inhibice substrátem - aktivace produktem Rychlost vs. enzym normáln přítomen kovalentní inhibitor zpomalování rychlosti - neměří se počáteční rychlost - pomalá spřažená reakce - přítomen nekovaletní inhibitor přítomen aktivátor [enzym]