Získaní enzymů • zdroje enzymů • izolace a purifikační postupy • uchovávání a stabilizace • komerční dodavatelé • studium struktury Zdroje enzymů • enzym lze získat z jakéhokoliv organismu • z cca 100 enzymů používaných průmyslově pochází přes 50% z plísní a kvasinek, 30% z bakterií, 8% z živočichů a 4% z rostlin • proč se preferují mikrobiální zdroje - levnější produkce - lepší kontrola a předpověditelnost obsahu enzymu - snazší získání surového materiálu o konstantním složení - v živočišném a rostlinném materiálu je více škodlivých složek (proteasy, inhibitory, fenolické složky) • snahy o zlepšení použitím tkáňových kultur i enzymy +++ > 100; ++ > 10; + > 1; - < 1 tun/rok Enzym EC číslo Zdroj Intra / extra cel. Rozsah produkce Použití živnočišný původ katalasa 1.11.1.6 játra I - potraviny chymotrypsin 3.4.21.1 pankreas E - kůže lipasa 3.1.1.3 pankreas E - potraviny syřidlo 3.4.23.4 žaludek telat (slez) E + sýry trypsin 3.4.21.4 pankreas E - kůže rostlinný původ aktinidin 3.4.22.14 kiwi E - potraviny a-amylasa 3.2.1.1 slad E +++ pivo ß-aniylasa 3.2.1.2 slad E +++ pivo bromelain 3.4.22.4 ananasový latex E - pivo ß-glukanasa 3.2.1.6 slad E ++ pivo ficin 3.4.22.3 fíkovníkový latex E - potraviny lipoxygenasa 1.13.11.12 sojové boby I - potraviny papain 3.4.22.2 papájový latex E ++ maso Nej běžnější enzymy Enzym EC číslo Zdroj Intra/ extra cel. Rozsah produkce Použití bakteriální a-amylasa 3.2.1.1 Bacillus E +++ škrob ß-amylasa 3.2.1.2 Bacillus E + škrob asparaginasa 3.5.1.1 Escherichia coli I - zdravotnictví glukosaisomerasa 5.3.1.5 Bacillus I ++ fruktosový sirup penicilinamidasa 3.5.1.11 Bacillus I - léčiva proteasa 3.4.21.14 Bacillus E +++ detergenty pullulanasa 3.2.1.41 Klebsiella E - škrob z kvasinek invert asa 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - sladkosti laktasa 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - mléčné produkty lipasa 3.1.1.3 Candida E - potraviny rafinasa 3.2.1.22 Saccharomyces I - potraviny N ej bežnejší enzymy Enzym EC číslo Zdroj Intra / extra cel. Rozsah produkce Použití z plísní a-amylasa 3.2.1.1 Aspergillus E ++ pečení aminoacylasa 3.5.1.14 Aspergillus I - léčiva gluko amylasa 3.2.1.3 Aspergillus E +++ škrob katalasa 1.11.1.6 Aspergillus I - potraviny celulasa 3.2.1.4 Trichoderma E - odpady dextranasa 3.2.1.11 Penicillium E - potraviny gluko saoxidasa 1.1.3.4 Aspergillus I - potraviny laktasa 3.2.1.23 Aspergillus E - mléčné produkty lipasa 3.1.1.3 Rhizopus E - potraviny syřidlo 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ sýry pektinasa 3.2.1.15 Aspergillus E ++ nápoje pektinlyasa 4.2.2.10 Aspergillus E - nápoje proteasa 3.4.23.6 Aspergillus E + pečení rafinasa 3.2.1.22 Mortierella I - potraviny Výroba enzymů • převládá několik mikrobů, dlouho známé a používané, produkce optimalizována mutací a selekcí • přednostně extracelulární a konstitutivní - event. levná a rychlá indukce • bezpečné kmeny, vysoká produkce enzymu • pohled uživatelů - důležitá stálá a známá aktivita - snadná skladovatelnost (lab. teplota, chladnička) - proces purifikace druhotný - nepřítomnost interferujících složek - bezpečná manipulace Producenti enzymů musí zvládat: • hledání nových a vylepšených enzymů • fermentační procesy produkující enzymy • purifikaci enzymů v průmyslovém měřítku • přípravu a balení enzymů k prodeji • spolupráci se zákazníky • vyjednávání s regulačními orgány Hledání nových enzymů • při hledání žádané aktivity se prohledávají mikrobiální kultury, získané obvykle z půdy, kompostu nebo kalů nacházejících se v přítomnosti potenciálního substrátu • metody bioinformatiky - prohledávání genových knihoven na výskyt sekvencí kódujících podobné enzymy • lze upravovat vlastnosti stávajících enzymů metodami proteinového inženýrství (cílená mutace vedoucí k vyšší aktivitě nebo žádané specifitě) Materiál pro získaní enzymů • zjištění velikosti přítomné aktivity v různých složkách materiálu - intra / extracelulární u mikrobů a tkáňových kultur, část rostliny nebo živočicha) - z čeho vycházet - v které fázi růstu je nejvyšší aktivita - kriterium porovnávání - specifická aktivita • první krok - převedení enzymu do vodného prostředí z pevného materiálu (za chladu, vhodný pufr, desintegrační metody) • další kroky - frakcionace Výchozí koncentrát rostlinné buňky část organismu mikrobiální fermentace intracelulární extracelulární ^ enzymy ^ L/S separace desintegrace buněk t t k(L) (S oofp4d L/S separace odstranění nukl. kyselin rostlinný latex koncentrace purifikační postup Desintegrace buněk potřebné úsilí závisí na typu organismu a částečně i na jeho fyziologii - někdy stačí pouze osmotický šok (změna iontové síly prostředí) -živočišné buňky, G- bakterie - rezistentní - kvasinky, sinice, mycelia, některé G+ bakterie (tolerují až 2 MPa osm. tlaku, "jako beton") ultrazvuk (ozvučování při 18 kHz -1 MHz) - rychlý sin. pohyb hlavice generátoru v kapalině, malý rozsah (pod 50 um), velké zrychlení (až 80000 g), nastává kavitace - mikrobublinky, tlakové vlny v důsledku jejich kolapsu až 300 MPa, buňky narušuje také střižná síla - některé enzymy konformačně labilní - mohou vadit i vznikající radikálové formy kyslíku vysokotlaké homogenizátory (Manton-Gaulin) - pumpa vytlačuje buněčnou suspenzi ventilem s malým otvorem, tlak přes 150 MPa, průtok až 10 m3/h Desintegrace buněk • kuličkové mlýny (kuličky 0,2 až 1 mm, ocel nebo sklo - Ballotini) - nárazy na kuličky, gradienty střižných sil - vhodnější pro větší buňky, méně pro menší bakterie • mrazové lisování (X-press, French press) - zmražená buněčná pasta se pod vysokým tlakem (150 až 230 MPa) protlačuje úzkým otvorem - desintegraci působí změny objemu a fáze (mikrokrystalky ledu) - vhodné pro termolabilní enzymy - obtížné použití pro masovou produkci • lytické metody - efektivní, nenákladné - osmotický šok, zmrazování / rozmrazování, studený šok, vysušování a lyofilizace, enzymová (lysozym na G+ bakterie) nebo chemická (kyseliny, báze, detergenty, rozpouštědla, chaotropní činidla) lyže • tepelné působení - může odstranit nežádoucí proteiny (zdenaturují a vysráží se) Nebezpečí při desintegraci buněk teplo - chladit; přidat enzymový substrát či analog, polyoly střižné síly proteasy - zrychlená práce, chlazení, inhibitory, nadbytek inertní bílkoviny pH - použití pufru, přidat substrát či analog, polyoly chemické faktory - vadí detergenty a rozpouštědla, rostlinné polyfenoly inhibují (adsorbenty - polyvinylpyrrolidon, redukce - askorbát) oxidace - přidat redukční činidla - askorbát, dithiothreitol pěnění těžké kovy (ionty - železo, měď, nikl) - přidat chelatační činidla - EDTA Precipitace • efektivní precipitace malých fragmentů buněk nesnadná - zvětšení velikosti - koagulací (odstranění el. náboje, pH změna) - flokulací (přidá se vhodný nosný materiál, na který se agregují opačně nabité částice) např. DEAE celulose, jednorázové použití • separace - centrifugace nebo filtrace Centrifugace • separace (sediment / supernatant) na základě velikosti částic a rozdílné hustoty • laboratorní centrifugy - výkyvné nebo úhlové rotory, vysoká úhlová rychlost u), velký poloměr otáčení r, ale malá kapacita a dlouhá sedimentační vzdálenost • průmyslové centrifugy - kontinuální plnění, kontinuální odebírání supernatantu, různé způsoby odebírání sedimentu - preferovány pro získávání sedimentu s enzymem, šetrné - minimální pěnění (nebezpečí inaktivace) Průmyslová centrifugace výrobci: Penwalt (a), Westfalia a Alpha-Laval (c) typické rychlosti: (a) 50000 g (100 g), 16000 g (až 5 kg) (b) 3000 g (semi/diskont. (c) 8000 g (a) tubulární - dlouhá dráha umožní vyčeření (b) kontinuální spirálová - šroub (jiná rychlost) posouvá sediment po povrchu (c) kontinuální multikomorová - paralelní disky poskytnou velkou vyčeřovací schopnost při krátké sedimentační dráze Filtrace * separace na základě velikosti částic • účinnost limitují: - tvar a stlačitelnost částic (blokování filtru) - viskosita kapalné fáze nástřik _ aplikovatelný přetlak Proč se enzymy purifikují • studium dějů v buňce - rekonstrukce metabolických a regulačních drah in vitro • studium průběhu reakce, kinetiky, regulace, ... • výzkum odchylek od normálního metabolismu či regulačního procesu - abnormální enzymy (mutace, onemocnění) • cílený návrh léčiv na základě známé 3D struktury enzymu • praktické použití jako biokatalyzátory či v medicíně potřebná míra čistoty samozřejmě závisí na dané aplikaci Purifikace enzymů • mírou čistoty enzymu je specifická aktivita (as), která narůstá v průběhu purifikačního procesu • obecně se z výchozího materiálu (frakce 0) purifikačními kroky (srážení, extrakce, chromatografie, aj.) získávají další frakce (N) • pro kvantitativní hodnocení se pro každou frakci provede její charakterizace - experimentálně se určí množství (objem VN), celková aktivita (aN) a hmotnost bílkoviny (mN) • následně se spočítají pro každou frakci: specifická aktivita as N = aN/mN výtěžek = (aN/a0)-100% stupeň přečištění = as N/as 0 • výsledek purifikace se pak přehledně zobrazí ve formě purifikační tabulky Příklad purifikační tabulky Purif. krok Objem Celk. aktivita Celk. protein Spec. aktivita Výtěžek Stupeň přečištění (ml) (nkat) (mg) (n kat/mg) (%) Hrubý extrakt 500 3000 15000 0.2 100 - Srážení síranem ammonným 100 2400 4000 0.6 80 3.0 lonexová chromatografie 45 1440 500 2.9 48 14.5 Gelová filtrace 50 1000 125 8 33 40.0 frakce0 l purifikační krok 1 frakce., i frakceN I čistý enzym celk. aktivita může i "narůst" - odstranění inhibitoru kontrola čistoty - SDS PAGE Purifikační kroky • precipitační metody • separace na základě velikosti • separace na základě náboje • separace na základě specifické interakce s jinou biomolekulou • jiné principy Precipitace (srážení) • frakcionace solemi - obvykle na počátku purifikace - zmenší se objem - principem pokles rozpustnosti bílkovin s narůstající iontovou silou, log(rozpustnosti proteinu) ~ iont. síle • používá se síran amonný - dobře tolerován, postupné zvyšování koncentrace - udává se ve stupni nasycení (0 až 1), max. rozpustnost 41.4 až 43.85 hm% (0 až 30 °C), precipitát se odcentrifuguje, pak se pokračuje dále - nízká teplota, pH blízko isoelektrickému bodu enzymu (nejmenší rozpustnost) • organická rozpouštědla - vhodné pro velkoobjemové procesy - mísitelná s vodou - ethanol, methanol, propanol, aceton, dioxan - principem snížení dielektrické konstanty prostředí, odstraní se povrchová voda proteinu - velmi pečlivě držet nízkou teplotu, jinak denaturace Tepelná denaturace • lze použít, pokud daný enzym je tepelně stabilnější než balastní bílkoviny, které zdenaturují a vysráží se • stabilizace enzymu - přidání substrátu, koenzymu či kompetitivního inhibitoru • několikaminutové zahřátí na 50 až 60 °C, pak rychlé ochlazení a odstředění balastů, případně odstranění inhibitoru dialysou • není univerzálně použitelná • ekonomicky výhodná metoda Fázová separace • některé polymery jsou ve vodném prostředí navzájem "nekompatibilní", což vede k separaci dvou vodných fází - využitelné pro separaci bílkovin - příklady: dextran/PEG, hydroxypropylovaný škrob/PEG - fáze vznikají při překročení kritických koncentrací obou polymerů (např. 2%dextran T500/10% PEG4000, první tvoří hydrofilní dolní hustší fázi, druhý lehčí hydrofobnější horní fázi) - polymery mají stabilizační účinek na proteiny - rychlá separace, mírné podmínky - vhodné pro průmyslové použití, kontinuální aplikaci, separaci od buněčných fragmentů • po přechodu enzymu do PEG fáze a jejím oddělení se provede další fázová separace s kone. roztokem soli či dalším polymerem • polymer lze vhodně modifikovat ligandem - afinitní fázové separace Chromatografické postupy • používá se vzorek v kapalné fázi • nejčastější ionexová, afinitní a gelová permeační chromatografie (použití v tomto pořadí) • nosič nesoucí vhodné funkční skupiny, funguje jako náplň kolony (i membránové varianty, případně kompaktní porézní monolitický materiál) • hnací silou přetlak (nízkotlaké a HPLC varianty, velikosti částic 50-150 um, resp. 4 - 6 um) • z kolony vytékají postupně jednotlivé frakce • hodnocení dle absorbance při 280 nm (koncentrace bílkoviny), dále se hledá aktivita ve frakcích • automatizovaný systém, včetně sběrače frakcí Chromatografický systém • nástřik vzorku (2-polohový ventil se smyčkou) • zásobník(-y) mobilní fáze (základní pufr, eluční pufr) • pumpy (peristaltické, lineární vysokotlaké, může stačit i hydrostatický tlak) • míchač gradientu • separační kolona • detektor (UV7VIS, absorbance, méně často fluorescence) • sběrač frakcí • řídící počítač a software lonexová chromatografie enzymy v rostoku mají náboj dle svého isoelektrického bodu pl a pH prostředí (pHpl negativní) a budou se tedy vázat na povrch s opačným nábojem reverzibilní proces, ovlivňuje pH a iontová síla (zvýšení normálně slouží pro eluci), eluce náhlou změnou pufru nebo gradientem nosiče na bázi pryskyřic, celulosy a jejích derivátů, zesítěná agarosa (Sepharose), Trisacryl, HEMA, polystyren nesoucí nabité skupiny katex: -SOs-, -OPOs-, -COO anex: -N+HR2, -N+R3 průmyslové použití je často vsádkové místo kolonového - opatrně míchat úlohu hrají porozita, mechanická odolnost, vazebná kapacita střední účinnost, typické přečištění 3x dodavatelé: Pharmacia, BioRad, Tesek, ... Afinitní chromatografie víceméně specifická interakce enzymu s ligandem (substrát, inhibitor, kofaktor,...) imobilizovaným na nosiči dnes široká škála technik i méně specifické varianty: - barviva podobná NAD+ pro purifikaci dehydrogenas - HIC, hydrofobní interakce (imobilizované krátké methylenové řetězce, např. C8, nebo fenyl), vnáší se enzym ve vysoké konc. soli (po vysrážení), eluuje se poklesem iontové síly, změnou pH či gradientem org. rozpouštědla - IMAC "immobilized metal affinity chromatography" - imobilizovaný chelát (NTA, nitrilotriacetic acid) naváže ionty Ni2+, které pak z druhé strany vytváří komplex s His skupinami enzymu (využívá se u rekombinantně připravovaných enzymů nesoucích na konci uměle přidané His zbytky (oligohistidine tag) - boronátová afinitní chromatografie - interakce imobilizované kyseliny borité se sacharidovými zbytky - glykosylované enzymy vysoká purifikační účinnost (až 1000x přečištění, typicky 10x) Princip afinitní chromatografie Metaloafinitní chromatografie Boronátová afinitní chromatografie • matrice s imobilizovanou kyselinou aminofenylboritou, případně aminofenyl-3,5-diboritou • vzniká komplex se sloučeninami obsahujícími diolové uskupení - typické pro sacharidy • možnost purifikace glykoproteinů Gelová permeační chromatografie • "size exclusion" chromatography, "gel filtration" • separace na základě velikosti biomolekul - větší molekuly projdou matricí rychleji - nevlezou se do pórů a nejsou tedy zdržovány • materiály: - zesíťované dextranové gely (Sephadex G, Pharmacia) - zesíťovaný polyakrylamid (Bio-Gel P, BioRad) - zesíťovaná agarosa (Sepharose CL, Superose, Pharmacia) - směs PAG a agarosy (Ultrogel AcA, LKB Instruments) - ethylenglykol methakryláty (Fractogel HW, Toyo Soda Co. -TSK) "Nácvik" purifikace enzymů • http://home2.btconnect.com/agbooth/archive /swingPP/ProtLab.html • program Proteins.COM (DOS okno ve Windows) Inaktivace enzymů • oddisociování koenzymu • disociace podjednotek u oligomerních enzymů • agregace (mohou vzniknout intermolekulové S-S můstky) • nevratné konformační změny • adsorpce na povrch používaných nádob • střižné síly vznikající pří proudění (ztráta aktivní konformace) • změny primární struktury - hydrolysa peptidové vazby - oxidace -SH skupin nebo indolového kruhu Trp, redukce S-S - chemická modifikace -SH skupin v aktivním místě - deaminace Asn - autoinaktivace při katalyse (vznikající volné radikály) Uchovávaní enzymů • zakoncentrování zředěného enzymu - ultrafiltrace - tlaková filtrace přes ultrafiltr vhodné porosity (aby enzym neprotekl) - systémy Amicon, centrifugační mikrofiltry - osmotické zahuštění - roztok enzymu v dialyzační trubici se obsype vhodným akvacidem - odnímá vodu (např. PEG) • stabilizační postupy - cílem je zachovat aktivní konformaci a zabránit rozvinutí, agregace či změnám v kovalentní struktuře - vyšší koncentrace enzymu - vysoká koncentrace neutrální soli - stabilizace hydrofobních interakcí (chaotropní efekt - narušení struktury obalové vody) -síran ammoný, hydrogenfosforečnan draselný - polyoly - glycerol (chrání i před vznikem krystalků ledu za nízkých teplot), sorbitol, manitol - snižují aktivitu vody, vytváří ochranný obal - hydrofilní polymery - polyvinylpyrrolidon, PVA, hydroxypropylcelulosa - "compartmnetalisation" - náhrada vzájemných interakcí vazbou na polymer - kovalentní derivatisace - např. u proteas se blokují lysiny - menší autolýza Ochrana enzymů • chránění -SH skupin - 2-merkaptoethanol, cystein, dithiothreitol (Clelandovo činidlo), dithioerythritol • chránění před proteinasami -fenylmethylsulfonylfluorid a EDTA • antimikrobiální prostředky (azid) • převedení do suchého stavu - lyofilisace - odstraní se soli dialysou - vysušení zmraženého roztoku ve vakuu (mrazová sublimace) • "lepší" enzymy - zdrojem isolace termofilní organismy - imobilisace - chemická modifikace - proteinové inženýrství (cílená záměna aminokyselin) Kontrola čistoty • elektroforesa za nativních podmínek - jediná zóna • SDS PAGE - určí se podjednotkové složení a molekulové hmotnosti • 2D elektroforesa - kombinace isoelektrické fokusace (určení pl) a SDS PAGE (Mr) • jeden pík při gelové permeační chromatografii • malé enzymy - hmotnostní spektrum (MALDI TOF) • frakcionace proteasou a MS spektrum vzniklých štěpů