1
Statistika a chemometrie v
klinické biochemii
(S j ký i lik i t ti tik j l b t ři
PF_statistika a chemometrie 2011 1
(S jakými aplikacemi statistiky pracujeme v laboratoři
klinické biochemie nejčastěji?)
P. Breinek
Oblasti, ve kterých nejčastěji používáme
v klinické biochemii statistické a
chemometrické postupy
Vnitřní(interní) a externí kontrola kvality (IKK a EHK)
Verifikace a validace metod
Zavádění nových metod
2
Zavádění nových metod
- analytických znaků metody
- referenční hodnoty/intervaly a rozhodovací kritéria(cut-off)
- pravděpodobnost určení diagnózy pomocí laboratorního
testu (klinická sensitivita a specifita, ROC, …)
- srovnání metod
- kritéria IKK
Systémy vnitřní a externí
kontroly kvality
Často vnímáme kvalitu subjektivně
Kvalitu musíme prokazovat
(požadavek plátců zdravotní péče
3
(p p p
=ZP)
Požadavky na kvalitu se mění
Chyby nevznikají jen v laboratoři
Kvalita (jakost)
• Definice kvality je orientována na splnění
požadavků zákazníka (ordinujícího lékaře)
• Normy řízení kvality
4
• Normy řízení kvality
• ISO 17025
• ISO 15189
Tři základní procesy:
Validace a verifikace
Návaznost
Nejistota
AKREDITACE=oficiální uznání, že laboratoř je
způsobilá provádět zkoušky (norma ISO 170 25 a
ISO 15189)
Akreditační orgán v ČR: ČIA,Český institut pro akreditaci
Akreditace, certifikace, audit
5
CERTIFIKACE neboli ověření fungování
vybudovaného systému řízení (ISO 9001)
Audit I a II (NASKL, Národní autorizační středisko klinických
laboratoří ČLS JEP)
Další informace
• www.cskb.cz
kk
6
• www.sekk.cz
2
Vnitřní kontrola kvality (IKK)
Postupy uplatňované pracovníky laboratoře
s cílem získat co největší míru
pravděpodobnosti, že vydávané výsledky
jsou maximálně věrohodné
7
jsou maximálně věrohodné
Vyšetřovaný vzorek analyzujeme 1x výjimečně 2x
(dvojmo).
•• Přesnost měření
(nyní: mezilehlá přesnost) náhodné chyby
Je kontrolována/sledována
8
• Pravdivost měření (správnost)
(nyní: vychýlení/ bias) systematická chyba
• Cílová nejistota měření
TMU (Target Measurement Uncertainty)
Detekce laboratorních chyb
Vnitřní kontrola kvality (IKK)
Software - řídící jednotka analyzátorů
- LIS
9
- LIS
- externí programy
Externí hodnocení kvality (EHK)
Detekce bias
Srovnání s jinými laboratořemi
Přesnost je statistickým vyhodnocením
náhodných chyb
Je to míra shody mezi výsledky získanými opakovanou
analýzou téhož vzorku za předem stanovených podmínek
Přesnost
Výsledky opakovaných analýz
10
Výsledky opakovaných analýz
jsou rovnoměrně rozptýleny
kolem průměrné hodnoty,
přičemž četnost jednotlivých
výsledků vykazuje normální
rozložení (Gaussovo rozložení)
Mírou rozptylu výsledků (s2) je směrodatná
odchylka (s, SD)
Je vyjadřována ve stejných jednotkách jako
Průměr, s, VK (CV)
11
měřená veličina
Čím je menší, tím je vyšší přesnost
Směrodatná odchylka (s, SD) závisí na měřené
hodnotě, proto se obvykle uvádí jako relativní
směrodatná odchylka, tzv. variační koeficient
(CV%)
12
(CV%)
3
Výpočty: mezilehlá přesnost
13
= těsnost shody mezi průměrnou hodnotou
získanou z velkého počtu výsledků měření (x) a
dohodnutou referenční hodnotou(x0)
Vychýlení(bias, dříve správnost)
14
dohodnutou referenční hodnotou(x0)
Mírou pravdivosti je velikost vychýlení:
bias = x – x0 …………………………….absolutní chyba
bias = [(x – x0)/ x0] . 100 (%) ……….relativní chyba
Kladná nebo záporná hodnota
Vztah mezi bias a přesností
15
Regulační diagramy
16
Stanovení požadavků na kvalitu
Empiricky (state of art)
Biologické variability, TEbiol
Kli i ké ž d k
17
Klinické požadavky
Doporučení odborných společností
Data výrobců IVD
Systém six sigma (6σ)
Celková analytická chyba, TEa
Příklad: Výpočet TMU (cílové
nejistoty měření) z biologické variability pro
stanovení S-kreatininu
18
4
Volba kontrolních materiálů
• s návazností
• jedna šarže
• stabilita
• nejlépe v kapalné formě
19
• nejlépe v kapalné formě
• atesty s ohledem na měřené hodnoty
Všechny hladiny (většinou 2) minimálně jednou
za analytickou sérii, která odpovídá jedné
pracovní směně. Maximální přípustná doba
analytické série je 24h.
Frekvence
20
Krevní plyny: všechny 3 hladiny denně, nejlépe
vždy po 8h jedna hladina
Imunochemie:optimem 3 hladiny denně,
minimálně střídavě jedna hladina denně
Další podmínka: vždy po výměně reagencií, po
kalibraci, po upozornění kontrolního systému,
servisním zásahu,……
Automatizace v klinické
biochemii
Analyzátory:
Selektivní = provádějí jen požadované
analýzy
Programovatelné (řízené PC tj postup
21
Programovatelné (řízené PC, tj. postup
analýzy, údržba, výpočty, QC,...)
identifikace reagencií i vzorků čárovými
kódy
Komunikace analyzátoru on-line s LIS
Možnost spojení s preanalytickými
procesy
•• rychlost: ( nejčastěji 100 - 2 000 analýz/ h
• objemy: analyzovaných vzorků 1 - 30 ul
reakční směsi 80 - 300 ul
22
• mycí stanice (kyvety,dávkovače, míchadla)
• řídící jednotka (PC)
• speciální software
• odvíčkování, centrifugace, alikvotace,
identifikace, uskladnění vzorků
Cobas 8000 (Roche)
23
24
5
• CHEMICKÉ (homogenní analýza)
• IMUNOCHEMICKÉ (heterogenní analýza)
Rozdělení automatických
analyzátorů
25
• Jiné:
CHROMATOGRAFICKÉ
MOČOVÉ
POCT
26
Externí kontrola kvality (EHK)
• Je součástí procesu zajištění kvality měření
• Principem je provádění mezilaboratorních
porovnávacích zkoušek
27
• Doplňuje jiné prvky zajišťování kvality
(validace, verifikace, vnitřní kontrola kvality,
návaznost, …)
• Přispívá k odhadu nejistoty výsledků měření
SEKK (Systém externí kontroly kvality,ČR)
DGKL (Německá společnost klinických laboratoří)
INSTAND (Ně ký i tit t t d di )
Organizátoři EHK
28
INSTAND (Německý institut standardizace)
NEQAS (Velká Británie)
atd.
Organizace EHK
Kontrolní cykly (podle časového plánu)
Dodání neznámých vzorků (většinou 2) s
příslušnými informacemi
29
p ý
Měření/stanovení (laboratorní dokumentace) počet
měření musí být roven počtu měření vykonávaných
u reálných vzorků pacienta, obvykle n=1
Vyplnění formulářů a zaslání organizátorovi
Organizátor vyhodnotí výsledky měření a rozešle
výsledky vyhodnocení
Referenčními metodami/postupy (RMP)
Validovanými metodami v kalibračních
laboratořích výrobců (AV)
Výsledky jsou srovnány s cílovými
hodnotami daného analytu
získanými:
30
ý ( )
Jako průměr výsledků měření všech účastníků
po vyloučení odlehlých hodnot (ALTM)
Jako průměr měření stejnorodých skupin
účastníků po vyloučení odlehlých hodnot (ConV)
6
Vyhodnocení vlastních výsledků
Souhrnné statistické vyhodnocení všech
účastníků
Zprávy pro účastníka
31
účastníků
Přehled metod a postupů
Kritéria pro posuzování výkonnosti účastníků,
obvykle formou tolerančních rozmezí s cílovými
nejistotami měření
Kontakty na odborné poradce(supervizory)
Souhrnná statistika
32
Youdenův graf
33
Certifikát (srovnatelnosti a návaznosti)
vydává se pro analyty vybrané Českou
společností klinické biochemie (ČSKB) a
34
společností klinické biochemie (ČSKB) a
Referenční laboratoří pro klinickou biochemii
(RL), platnost certifikátu 1 rok
Osvědčení o účasti
vydává se pro analyty, které splnily podmínky pro
přidělení osvědčení o účasti
Jak řešit neúspěch
Prozkoumat možné příčiny
Provést Záznam o neshodě a přijmout
nápravná opatření
35
nápravná opatření
Je možné požádat o konzultaci supervizora,
RL, regionální odborníky, představitele
Výboru ČSKB
Zúčastnit se dalšího kontrolního cyklu
Zavádění a výběr nových
metod
Od 7.12.2005 laboratoř smí používat pouze
produkty se značkou CE (Evropská unie)
CE = Conformité Européenne, značka evropské shody
Vý b č j ž ý b k lň j
36
Výrobce zaručuje, že výrobek splňuje
direktivu IVD 98/79 EC, tj. požadavky na
zdravotnické prostředky in vitro
IVD = in vitro diagnostikum
Výrobek je validovaný a má mít
metrologickou návaznost hodnot kalibrátorů
a kontrolních přípravků
7
Validace a verifikace
VALIDACE
-splnění požadavků na měřící postup s
ohledem na jeho zamýšlené použití
37
j ý p
-důkaz ve formě dokumentace, že metoda
bude poskytovat výsledky odpovídající
předem určené specifikaci
VERIFIKACE
-potvrzení, že laboratoř je schopná
validovaný měřící postup správně provádět
Kdo validuje a verifikuje?
Validuje:
Výrobce diagnostik (direktiva IVD 98/79 EC)
Případně i laboratoř ( j t btíž é)
38
Případně i laboratoř ( je to obtížné)
Verifikuje:
Laboratoř
Jak často se provádí validace a
verifikace?
Verifikace minimálně 1x ročně
Výsledkem je verifikační protokol s
39
Výsledkem je verifikační protokol s
odhadem nejistoty měření
Co se validuje a verifikuje?
(Analytické znaky metody)
Přesnost a vychýlení
Pracovní rozsah/ linearita
Citlivost (mez detekce/ stanovitelnosti)
40
Citlivost (mez detekce/ stanovitelnosti)
Interference
Robustnost
Porovnání s jinou metodou
Při verifikaci jen ověřujeme, že jsme v
laboratoři schopni dodržovat uvedené
analytické znaky metody
Verifikační protokol
41
Verifikační protokol
42
8
43
44
45
Nejistota = kombinace náhodné a
systematické chyby
Normy řízení kvality ukládají každé
Nejistota (Uncertainty)
46
Normy řízení kvality ukládají každé
laboratoři vyhodnotit nejistoty svých
měření
Příklad zjištění návaznosti
měření koncentrace P-GLUKÓZY
(dokumentace pracovního kalibrátoru)
47
Rutinní metoda: GOD-PAP
Referenční metoda: ID-GC/MS
Referenční materiál: NIST-SRM 965
Kalibrační hodnota: 10,4 mmol/l
Nejistota: 0,132 mmol/l ( 1,2%)
Porovnání s jinou metodou
Lineární regresní závislost
Y = a.X + b
k l č í k fi i t ( ) t l ( )
48
korelační koeficient (r), rozptyl (syx)
Regresní závislost dle Passinga-Babloka
Demingova regresní závislost
Vyhodnocení dat (!), chyba konstantní a
proporcionální, významnosti,…
9
Návaznost
provázání rutinních měření s referenčními
metodami a referenčními materiály
Realizace návaznosti v klinické laboratoři je velmi
btíž á
49
obtížná
U biologických analytů je k dispozici jen asi v 10 -
20% případech referenční materiál/ referenční
metoda měření
Jak ji můžeme zjistit?→→ rozborem dokumentace
výrobce
Další chemometrické postupy
používané v klinické biochemii
stanovení referenčních hodnot/intervalů,
rozhodovacích kritérií (cut-off)
pravděpodobnost určení diagnózy pomocí
50
p a děpodob ost u če d ag ó y po oc
laboratorního testu (klinická sensitivita a
specifita, ROC, prediktivní hodnoty,…)
plánování experimentů
statistické testování, multivariační analýza,…
Cut-off (rozhodovací limit)
Je to koncentrační hladina markeru, pod kterou
leží většina hodnot zdravých lidí.
51
Specifita
Udává procento správně negativních výsledků ze
souboru zdravých.
Čím vyšší specifita, tím je méně falešně
52
Čím vyšší specifita, tím je méně falešně
pozitivních výsledků.
počet správně negativních výsledků
Specifita (%) = --------------------------------------- x 100
celkový počet zdravých
Sensitivita (citlivost)
Udává procento správně pozitivních výsledků ze
souboru nemocných.
Čím vyšší sensitivita, tím je méně falešně
53
Čím vyšší sensitivita, tím je méně falešně
negativních výsledků.
počet správně pozitivních výsledků
Sensitivita (%) = --------------------------------------- x100
celkový počet nemocných