Protein engineering Změna primární struktury proteinu s cílem získat nový protein s požadovanými vlastnostmi Zvýšení odolnosti proteinů teplota pH osmotický tlak Zesílení interakce terapeutické protilátky Změna specificity interakci fosfospecifické protilátky Vytváření nových vlastnostní fluorescenční proteiny změna isotypu protilátek Změna enzymatické aktivity biodegradace Fůzní proteiny Editace genomu specifické nukleázy cílená změna design na základě znalosti struktury a vlastností mnohastupňový proces kombinace v obou přístupů náhodná změna in vitro evoluce Cílená změna NMR X-ray strukturní alignment modelování predikce Bodová mutageneze kombinace mutací selekce <^ empirický test (in vivo, ex vivo) PoPMuSiC Prediction of Protein Alt/fan f Stability Changes Output nuHt sUibiliiiina neutnd [ILULiLÍ"J]]i most destabilizing IIIULMJUCU Enhancing the stability and .solubility of TEV protease using in silico design USA U CABR/TA,'J IIMIId GIUS." AW J* Kf BhRTOH* WK! l^rtiUl MAKJANSK RtHAiw ,sr STHPW--N P. BOlTOMlfcY' ttnnmj 11 3HI? Hul ft.; ■ I * I. W? tin™ Ji*T 15. 3W7j In vitro evoluce Heterogenní populace Genotyp Fenotyp Kompetice Selekce Podmínky nutné pro in vitro evoluci: •kompartmentace genotypu a fenotypu •heterogenita genotypu-mutace •schopnost amplifikace Design in vitro evoluce: požadavky na fenotyp i způsob selekce Způsoby kompartmentace genotypu a fenotypu Ribosomal display Emulsní systémy Phage display Exprese na povrchu bakterií m r-^ In vitro transkripce translace GFP Green Fluorescent protein Cíl změny GFP •Vyšší intenzita •Změna vlnové délky •Možnost fůze s ostastními proteiny •Krátký nebo dlouhý poločas rozpadu •Rozpustnost •Monomer Evoluce PCR enzymů Only improved variant s survive tire selection. KAPA SYBR*' DNA Polymerase was evolved specifically for real-lime PCR and outperforms wild-type- Taq. jn^lfmUm Hoi Gene variants, are oornpa rlmental ized and e*press«J in emulsion followed by high-lhrougfipul screening in the presence of selection pressure. Wild-type gene coding for Taq DNA Polymerase. Mutagenesis creates la gene Irtxriry of 1 Jf ID8 random variants. Phage display • Knihovny peptidů po produkci si zachovají kódující sekvence • Je nutné provést selekci na vašem cílovém proteinu „Phage display" • Exprese peptidů na povrchu • Obvykle se k expresi využívá gen 111 • 5 kopií Konstrukce peptidových knihoven Transfekce do bakterií a produkce fágů Provede se eluce navázaných fágů liji Selekční proces 1 4 Aplikuje se knihovna na cílový protein Od myjí se všechny nenavázané fágy Příklad Mapování anti-p53 protilátky PAb 240 1/12/2011 Selekce PAb 240 vazebného peptidu z náhodné "phage display" peptidové knihovny "p53 sequence" "Phage library sequences" Selekce mdm2 vazebných peptidu z náhodné "phage display" peptidové knihovny "p53 sequence" PLSQET FSDLWKLL PENNV "Phage library sequences" frlPR FMDYWEGL N VQN FIDYWTQQ F TGPA FTHYNATF IDRAPT FRDHWFAL V PEPLAV FADYWETL Y PA FSRFWSDL SAGAR Shoda xxxPx FxDYWxxL xxxxx S3788K Bioloogic Vear OKT3 1986 — /////// ReoPro* 1994 — 1995 — 1996 Rituxan* 1997 Zenapax® 1997 Remicade* 1998 Enbrel* 1998 Herceplin® 1998 Simulect® 1998 — 1999 Mylolarg® 2000 Campalh® 200! Zevalin® 2002 Xolair® 2003 Rapliva® 2003 Amevive0 2003 Bexxar 2003 Humira® 2003 Erbiiux® 2003 Avaslin 2004 Tysabri® 2004 Aciemra® 2005 Orencia* 2005 Lucentis® 2006 Veclibix® 2006 >$80M in 2006 S4.0H H 60- I 50 1 40- I = 30- 20 - 10- O Fc fusion protein CD Human Mab O Humanized Mab . | Chimeric Mab _] Murine Mab C=L_FL_R I 1W5 If all (unlikely) current Phase III candidates wen: to be approved in next i-4 years <100% POS) 75* POS (industry average) would yield approx ca. 55 marketed Mabs and l-c fusion proteins If -50% of current Phase III candidates arc approved in next $-A years (50* POS) If all current BLAs arc approved and result in marketed biologies Current status as of July iOOS (Current status] -50 — Mi -31 -20 -Mi C„3 ' - l_ _ I _ ■ g _ fl C«Z Co-etant regioi CH3 coc coo Fig. 7-34: Diogrom of Immunoglobulin 6 IgG s Fab F(ab') (fragment anupen bndinp) Fab' scFv l&irvpw-cJiain variatfe fragment) di-scFv sdAb (single domain amibody) trifunctional antibody chemically linked F(ab% BiTE (bl-tpecific T-c*fl engage*) Germline V-gcne segments Human B-cells from narve or immune donors Gene assembly in vitro VH (or VHCH1) VL (or VLCL) IIF ^1£^ Gene Assembly and f cloning or Stepwise cloning Introduce into E.coli Immune, Naive or Synthetic Antibody Library of Human Fab fragments Rescue ZincFinger nucleases TALE nucleases dHax3 Repeat domo ns NLS AO N IIIIII 1 1 1 - c 1.--* 1213 34 LTPEQVVAIASfcUGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 0123456789 10 11 11.5 1 Hax 3 Nt HD Nl HD HD HD NS NS NS HD N! NG Hax3-box TACACCC AAA CA T 0 1 2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 11.5 dHnx3 HD HD HD NG NG NG NSNG HD NG HD NG dHax3-box TCC CT TTATCTCT dHax3-N Repeat domains NLS AD 18 TALE domains IIIIIIIIIIIBB"—^ FOK1 domain 18 bp DNA sequence 3S7aa 196a a 5144 Transcription Activator-Like Effector Genome Editing