‹#› 1 Analytická chemie životního prostředí – organické polutanty Jana Klánová klanova@recetox.muni.cz ‹#› 2 Analytical chemistry of the environment – organic pollutants Jana Klánová klanova@recetox.muni.cz ‹#› 3 Sylabus 1.Úvod Význam analytické chemie při kontrole znečištění životního prostředí. Zdroje a transport polutantů v prostředí. Rozptyl, degradace a akumulace polutantů v prostředí, perzistence a biokoncentrace. Specifické problémy environmentální analýzy, obecné schéma analytického postupu. 2. Vzorkování Kvalita vzorku, jeho velikost a počet, strategie odběru, vzorkovací plán, odběrový protokol, konzervace, transport a skladování vzorků. Techniky odběru vzorků ovzduší, aktivní a pasivní vzorkovače, atmosférická depozice, odběr srážkových, povrchových, podzemních vod, odběry tuhých vzorků, půd, odpadů, sedimentů, bioty. 3. Techniky přípravy environmentálních vzorků Úprava vzorku před analýzou, extrakce tuhých vzorků (Soxhletův extraktor, automatizovaná extrakce – Soxtec, mikrovlnná a ultrazvuková extrakce, superkritická fluidní extrakce), extrakce vodných vzorků (kapalinou, plynem, na tuhou fázi), analýza rovnovážné plynné fáze. Čištění a frakcionace vzorku (kolonová kapalinová chromatografie,gelová permeační chromatografie) 4. Techniky analytického stanovení Chromatografické techniky, jejich princip, instrumentace, využití, interpretace dat. HPLC, GC, výběr kolon, fází, detektorů, GC-MS 5. Postupy stanovení významných polutantů ve složkách životního prostředí Prioritní polutanty, nové typy sledovaných polutantů, vlastnosti PCBs, PCDDs/Fs, PAHs, pesticidů, fenolů a chlorfenolů a jejich stanovení ve vzorcích ovzduší, vody, půd, sedimentů, bioty (homogenizace, extrakce, rozklad kyselinou, odstranění lipidů a interferentů, frakcionace, zakoncentrování, GC-ECD, GC-MS, HPLC). 6. Kvalita dat, základy QA/QC a GLP Kalibrace, její rozsah a linearita. Citlivost metody, mez detekce a mez stanovitelnosti. Přesnost, správnost, shodnost analytických dat, reprodukovatelnost a opakovatelnost. Výtěžnost metody, referenční a certifikované materiály, obohacené a slepé vzorky, regulační diagramy. Mezilaboratorní srovnávací testy. Základy GLP, validace a verifikace metod, dokumentace, plány, standardní operační postupy, protokoly, uchování dat, akreditace. ‹#› 4 Literature: Reeve R.: Introduction to environmental analysis Fifield F.W., Haines P.J.: Environmental analytical chemistry Skoog D.A., Leary J.J.: Principles of instrumental analysis Hewitt C.N.: Instrumental analysis of pollutants Keith L.H.: Environmental sampling and analysis Popl M, Fahnrich J.: Analytická chemie životního prostředí ‹#› 5 Persistent Organic Pollutants Resistent to chemical, biochemical, photochemical degradation Long life-time in the environment (years) Physical properties supporting a high degree of mobility in the environment Can be bioaccumulated in food chains Toxic properties at low levels (ng-mg.kg-1) or toxic metabolites Main groups: technical chemicals, pesticides and industrial by-products ‹#› 6 Sources of pollutants -Point sources -Diffusive sources - - ‹#› 7 Fate of the pollutants in the environment - Transport Persistent toxic substances (based on their octanol/water Kow and octanol/air Koa partitioning coefficients) are often a subject of the transport in the environment (within or between compartments), including a long-range transport - Bioconcentration (bioconcentration factor) - Bioaccumulation (bioaccumulation factor) - Biomagnification (between the trophic levels of the foodchain) ‹#› 8 Distance “Hot spot” Dilution Dispersion Degradation Typical pollution gradient ‹#› 9 “grass-hopping” high latitudes deposition > evaporation low latitudes evaporation > deposition mid latitudes seasonal cycling of deposition and evaporation long range atmospheric transport degradation and permanent retention long range oceanic transport Temperature gradients in space in combination with atmospheric mixing will favour gradual transfer from warm to cold regions on both global and regional scales Because rates of deposition and evaporation are temperature-dependent, hopping is enhanced by periodic temperature changes Long-range transport of PTS, e.g. HCB Frank Wania ‹#› 10 ‹#› 11 ‹#› 12 Global monitoring ‹#› 13 Integrated monitoring of PTS ? A comparison of the contamination on the regional and local levels, a trend determination ‹#› 14 UNEP Chemicals/GEF „Regionally-Based Assessment of Persistent Toxic Substances“ a global inventory GEF/UNIDO Project „Enabling activities to facilitate early action in the implementation of the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (POPs Convention)“ Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants ‹#› 15 What do we need to evaluate ? - a source reduction - an exposure reduction –of humans –Of susceptible biota - an effects reduction ‹#› 16 Temporal trends PBDEs: Anna Palm (Pers. Comm.) PCBs: Breivik et al (2002) ‹#› 17 Global monitoring of PTSs WHO : Global Environmental Monitoring System, and GEMS/Food includes some PTSs WMO : Global Atmospheric Watch where PTSs are measured UNEP : Global Monitoring Programme for the 12 POPs in the Stockholm Convention is planned ‹#› 18 Global POPs Monitoring Network UNEP Workshop on Development of a Global Monitoring Programme to Support the effectivness Evaluation of the Stockholm Convention UNEP Chemicals, 24-27/03/2003, Geneva, Switzerland Ambient air (super stations, passive samplers) Wildlife (region specific – bivalves, fish, bird eggs and marine mammals) Human milk ‹#› 19 Regional approach Regional Report - Region III - Europe Final Regional Report was prepared by Regional Team III – Europe and group of regional experts ‹#› 20 Regional monitoring programmes UN ECE Convention on Long Range Transboundary Air Pollution – POPs Protocol - includes the measurements of several PTSs in the air EMEP Activities AMAP collects data on PTS levels in the Arctic region Marine conventions in Europe (OSPAR, Helsinki, Barcelona and Bucharest Conventions) collect data from the marine environment The Water Framework Directive demands a large amount of new data to be produced in EU DG Environments initiative ”Health and Environment” ‹#› 21 Monitoring - is a long-term consistent observation or measurement of precisely defined indicators well described in the space and time - is performed in the monitoring network representative for the region - consists of the observations and measurements, evaluation of the current status, changes as well as future perspectives. - Environmental monitoring is at the very beginning of the environmental information chain: - it is the basis of environmental data collection, - environmental reporting and environmental research, - the basis of understanding of environmental problems and trends. ‹#› 22 Monitoring programmes should - be developed in accordance with the demands of the current legislature - monitor the efficiency of the strategic documents such as international conventions and protocols or national measures with respect to the environment Monitoring outputs - evaluation of the exposure within systems - evaluation of the human and ecological risks - support of decisions - changes in economic practises, legislature, operation and strategies - determination of efficiency of accepted measures, funding, etc. ‹#› 23 Environmental monitoring is therefore a powerful tool for -supporting a decision-making - enforcing policy decisions - assessing compliance with policy regulations and objectives. These programmes are essential in identifying subsequent measures. The crucial elements in the development of the monitoring program are the measurement methods and standards. Is monitoring only a rutine procedure or it can be used as a tool for study of environmental processes ? ‹#› 24 Measurements of substances in the environment Screening - is it possible to detect the substance in environmental samples? Survey - how big is the problem? Monitoring - long-term measurements of the temporal trends and/or - large scale measurements of the spatial distribution Modeling - where is the substance ? ‹#› 25 Harmonisation of monitoring programs It is important that data from different sources are comparable for the same parameter Intercalibration of the analytical laboratories requires significant efforts Various approaches of existing monitoring programs represent currently the major problem (various matrices, frequency, sampling procedures, etc.) Local – national – regional – global levels ‹#› 26 Continuous analysis is required to develop a functional monitoring program for the evaluation of the chemical contamination of the environment - problem definition - survey for determination of the extent of the problem - development of the optimal analytical procedures - evaluation of the current status and future development - human exposures and risk evaluations - sugestion of applicable measures - legislation for efficient evaluation - monitoring for the effectiveness evaluation of the measures ‹#› 27 Specific problems of environmental analysis - wide range of concentrations and properties of analytes - limited stability of the matrices and analytes - non-homogenity of the samples - application of advanced methods of extraction from environmental matrices - monitoring on the levels close to the detection limit (trace and ultratrace analysis) - risk of secondary contamination - costs of instrumentation, chemicals, standards ‹#› 28 General scheme of analytical procedure - sampling - conservation - transport - storage - sample preparation - extraction - clean-up, interferent removal - fractionation - concentration - derivatization - analytical procedure - data interpretation ‹#› 29 Sampling - initial stage - selection of analytes - selection of sampling sites - number of samples, sampling frequency - sampling methods and strategy - quality assurance - representative samples - sufficient size - stability - optimal data value : cost ratio ‹#› 30 Quality assurance - sufficient documentation (number and code of the sample, sampling site, date and time, site-specific information, meteorological data, responsible person, sampling methods) - preservation of the sample quality (inert containers, immediate transport, proper storage, cooling, freezing, lyofilization, analysis) ‹#› 31 Air Air is a key medium - responds quickly to sources Air concentrations fluctuate widely in the space and time Various concentrations in the gas/particulate phases - compromise over the sample time/volume/technique Short-term sampling/bulking ? Air sampling ‹#› 32 Air sampling - ambient air - permanent gases - volatile compounds - particules - indoor air - working environment - emissions - imissions ‹#› 33 Emissions (chimneys,ventilations) continuously Ambient air (environmental levels) sampling point, frequency K11o P1010023 Air sampling ‹#› 34 Meteorological parameters are crucial for the air sampling temperature atmospheric pressure relative air humidity sun irradiation precipitation wind velocity wind direction precipitation P1011758 P1010006 ‹#› 35 Air sampling techniques - sampling of the volatile compounds using a fixed volume container (canister, gas-tight syringe) - absorption of the gas in solution (container with the absorption liquid, absorption liquid impregnated filter – the volume calibration is a necessity) - gas sorption on various sorbents (detection tubes with activated carbon, silica, polymers, denuders – not for the aerosols) - particule sampling (high volume sampling using the quartz and polyurethane foam filters, respirable - < 5um- fraction sampling cascade and cyclone impactors, VAPS universal sampler) - passive samplers (PUF, XAD, semipermeable membrane) ‹#› 36 ‹#› 37 ‹#› 38 ‹#› 39 High volume samplers for active POPs sampling P1011633 P1011667 ‹#› 40 Polyurethane Foam Filter PUF Air Pump Sampling Techniques High-Volume sampler Particulate Phase Gas Phase Glass Fiber Filter GFF Particles Gas ‹#› 41 KJones_7 Active sampling Active sampling – cost, training, power, supporting meteo data Establishment of the regional ‘super stations’? ‹#› 42 Dust aerosols samplers P1011641 P1011643 P1011637 P1011636 ‹#› 43 ‹#› 44 ‹#› 45 ‹#› 46 Samplers of PAHs from PM10 fraction P1011634 P1011822 ‹#› 47 ‹#› 48 Passive sampling This technique provides a cheap and powerful tool for obtaining detailed spatially and temporaly resolved data and evaluating the trends. A number of exciting developments have been made in this field in recent years; the feasibility of passive samplers has been demonstrated for the local, national and regional scale monitoring. KJones_5 ‹#› 49 ‹#› 50 •Time dependence of the analyte concentration in collecting media ‹#› 51 Semipermeable membrane device Polyethylene, low density, thickness 75 – 90 mm, sleeve of 91 cm * 2,5 cm with 1 ml of trioleine SPMD ‹#› 52 SPMD for air sampling ‹#› 53 resin-filled stainless steel fine mesh cylinder coarse mesh carabine & loop stainless steel lid bottom part of stainless steel shelter adjustable hose clamps 10.5 cm 15.5 cm XAD-Resin Based Passive Air Sampling System for POPs Wania F. et al., Environ. Sci. Technol., 37,1352-1359 (2003) ‹#› 54 pasiv_sampler_whole PUF based passive samplers ‹#› 55 The advantages of passive air samplers: ÄLow cost ÄHigh spatial and temporal sampling resolution ÄNo power supply needed ÄEasy deployment and little operator training required ‹#› 56 Their disadvantages: ÄCurrent techniques are ‘semi-quantitative’, requiring knowledge of the sampling rate (m3 of air sampled/day) ÄOptimization of the sampling rates requires the assessment of meteorological parameters (wind speed, temperature) ÄSampling is efficient for the gas phase component, but generally poorer for the particulate phase ÄTime to gas phase-sampler equilibrium varies between POPs ‹#› 57 Selection of sampling sites Points to consider: ÄPotential source of contamination (local sources, air or water transport, distance to the urban or industrial facilities) ÄTerrain configuration – inversion valley, lowland, hills ÄLocation of sampling sites – height (1.5 -2 m – respiratory zone – local sources; 6-10 m –evaluation of the long-range transport - vicinity of sampling site – natural or anthropogenic barriers, hills, trees, buildings – traps for dust, „immission shadow“ - surface in the sampling site – grassland is the best; sand, soil, asphalt or other surfaces are potential sources of contamination ‹#› 58 ÄMeteorological conditions before and during the sampling - wet deposition (rain, snow,) – scavenging effects - wind speed: low – effect of local sources, high – emissions are dispersed, effect of the long-range transport - wind direction – important for selection of the sampling site - temperature: high – evaporation of highly volatile compounds from the soils and other surfaces; low – effect of the local heating systems - humidity: low – higher amount of dust and particles, increased sorption of contaminants; high – effect of the humidity on the sampling etc. process ÄOther – i.e. nature of dust ‹#› 59 Combined samplers for PAH sampling P1011826 P1011807 active sampler passive samplers P1010004a ‹#› 60 Atmospheric deposition - wet (delivered by rain and snow, major in the clean and background sites) - dry (sedimentation of atmospheric dust particles, prevailing in urban sites) Atmospheric deposition sampling - wet (sampling of rain only, automatic devices) - dry (deposition in the sampling containers is a function of the air concentration of particles and the sedimentation rate) - sum of the wet and dry deposition (open containers) ‹#› 61 - Vertical deposition – rain, snow, particles - Horizontal deposition - aerosol, fog Horizontal sampling of aerosols is the analogy to the gas phase sampling - membrane filters (Sympor) - flow measurement (rotameter) - volume measurement (gas meter) - air pump Sampling of wet atmospheric deposition ‹#› 62 Horizontal sampling of fog and icing pasivní kolektor P1010031 Fan kolektor rotační arm kolektor passive active ‹#› 63 Fog samplers mlhoměr1 aktivní kolektor2 Passive Active ‹#› 64 A) manual samplers Samplers for vertical deposition P1011670 P1011616 P1011775 P1011628 P1011779 ‹#› 65 B) automatic samplers (dry or wet deposition) - Automatic switch of configuration for dry and wet deposition (sensor for the change of conductivity with the first drop) - Colection area 0,2 - 1,0 m2 (teflon, PE, steel, glass) – a lid is closed between the sampling events) - Sampling reservoir of sufficient volume (bottles on carusel), inert materials, thermostat (4-10°C), sample conservation (HCl, HNO3, H2SO4, chloroform) - Simple and robust construction, resistent to extreme meteorological conditions Samplers for vertical deposition ‹#› 66 P1011620o P1011764o P1011797 Colective area Lid Reservoir of sample Samplers for vertical deposition ‹#› 67 P1011767 P1011769 P1011782 P1011781 Sensor for „first“ drop (flake) Closed Open Samplers for vertical deposition ‹#› 68 Water pollution - organics Primary – waste water, deposition, leaching Natural (humic substances, phenols,..) Ä Anthropogenic (oil pollution, pesticides, detergents, PCBs) P1010063 ‹#› 69 P1013858u P1013582 (1) rezan Natural „pollution“ ‹#› 70 PIC00005 Spolana2 P1013679o2 Industrial waste waters smolnik-odkalisko ‹#› 71 P1013673o P1013577 (1) P1013580 (1) P1013676 Agricultural pollution ‹#› 72 Eutrophication Eutrophication-1 ‹#› 73 Types of waters a) atmospheric b) surface c) subsurface d) groundwater a) drinking b) household c) technological d) waste Purpose ‹#› 74 Equipments and apparatus for surface sampling P1013131u P1013137u ‹#› 75 B) Equipments and apparatus for depth sampling (depth samplers) P1013136u P1013001a ‹#› 76 Material and construction of samplers and sample bottles Sampling bottle or transport container is in the contact with the sample from sampling to treatment Material has to be resistent to samples and their components - must not reduce or enrich the content of analyte - no bactericide effects - must allow sterilization or conservation - glass, plastic, stainless steel Samplers - anticorrosive steel, (Cr, Ni, W, Mo, Al), inert plastics - mechanicly resistent ‹#› 77 Advantages of integrative samplers Techniques include: Fish Mussels – the international ‘Mussel Watch’ programme for coastal waters Passive samplers – e.g. SPMDs ‹#› 78 SPMDs - Semipermeable Membrane Devices SPMD_Princip J. N. Huckins et al., Chemosphere 20(5): 533-552 (1990) ‹#› 79 spmd_photo •mimics uptake of dissolved contaminants by biota (estimation of bioaccumulation) (designed by Huckins et al.; U.S. Geological Survey) Semipermeable Membrane Device (SPMD) Thin film of triolein (“lipid phase”) encolsed in a lay-flat LDPE membrane. •applicable for sampling of more hydrophobic POPs in water and air ‹#› 80 foto227 Albrecht_im_Spittelwasser Safira4 Water monitoring using SPMDs Elke_ in_Mulde ‹#› 81 Membrane-enclosed SPME fibre for passive water sampling Membrane Coil spring (stainless steel) PDMS-coated SPME fibre Fluid filling ‹#› 82 Silicon rubber based samplers ‹#› 83 Mussels cage 12200009 ‹#› 84 Processing of mussels mussles dripping mussel homogenisation mussel homogenisation process mussel homogenised in bottles ‹#› 85 KJones_11 Monitoring of fish ‹#› 86 Sampling of sediments and soils - most difficult matrix for sampling - heterogenous materials, limited migration - influenced by biological activity, fertilization, rain - pilot sampling to gain the first information about the variability - several samples are mixed to produce the composite sample - common sampling depth 15-20 cm (unless interested in the soil or sediment profile) ‹#› 87 Soils and sediments High environmental burdens – important for global balances Slow response times Background soils and sediments reflect spatial differences in cumulative atmospheric deposition/net air-surface exchange Very heterogeneous - important questions of depth, ecosystem type etc. Can show spatial trends, but poor for time trends ‹#› 88 Historical data collection of samples from the bottom depth horizons with the limited sediment mobility Actual state: sampling of the upper horizon (max. 15 cm) of the bottom sediment sampling using the sedimentation traps in the profile of the river The choice of the sampling method is derived from the granularity of sediments. Sediment sampling ‹#› 89 Granulometric distribution of sediments Granulometry of sediments [mm] Stones > 63,00 Rough gravel 63,00 - 20,00 Medium gravel 20,00 - 6,30 Fine gravel 6,30 - 2,00 Rough sand 2,00 - 0,63 Medium sand 0,63 - 0,20 Find sand 0,20 - 0,063 Clay < 0,063 Colloid and rough dispersion 10-4 - 10-6 ‹#› 90 Most important Sediment fraction with granularity finer than 1 mm is responsible for majority of sorption processes Coloid and rough dispersions of endogennous and autigennous components. freeze-core7a2 P1010005u ‹#› 91 P1010001 Odber3 Probe for sampling of fine compact sediment ‹#› 92 Piston probe Grab probe Sediment sampling ‹#› 93 P1013126u1 P1013129uv P1013128u P1013126u2 Deep probe ‹#› 94 P1011707 P1011699u Grab probe P1011705p P1011702p ‹#› 95 Collection of samples from reservoirs Samples are not collected randomly, but along the transect across the reservoirs (lake, pond, dam). Sampling protocol has to include a direction of transect and the localization of the sampling sites. Individual samples characterize the thickness of sediment layer in the selected sampling depth. A recommended size of the composite sample is approximately one kilogram of the dry weight (2-3 kg of wet sample). ‹#› 96 Colletion of samples from streams and rivers One composite sample is collected every 1 000 m over the length of stream. Every mixed sample consists of at least 3 individual samples taken 100 m apart. Samples are collected in the cross profile of stream. Sampling sites are described in sampling protocol. The recommend mass of composite sample is approximately 1 kg of the dry weight (3-5 kg of wet sample). ‹#› 97 Sediment sampling by „scraper“ sampler sedimenty ‹#› 98 Freezing sampling FRCORE2 Freezing medium Tube probe Disperser of media flow Frostbitten sediment ‹#› 99 Freezing sampling – installation of the probe freeze-core4a freeze-core6a ‹#› 100 Sediment traps TRAP4_M FIGURE2 ‹#› 101 Sampling of suspended matter (US Geological Survey) ‹#› 102 Sampling by diver POTAPENI2a Winter zmP5110005 Summer ‹#› 103 Basic soil components ‹#› 104 Types of soil monitoring Ä Agricultural, arable soils of various types (field, gardens) Grasslands Forest soils Protected areas Industrial areas ‹#› 105 Methods of soil sampling Sampling area: Arable soils and grassland – 7 - 10 ha (according to soil conditions and production area) for one sample Hop-garden – area for the collection of 1 mixed sample – 3 ha Vineyard - 2 ha Database – one sample per 1km2; 1 mixed sample is composed of 30 nicks uniformly cover the ing whole investigated area Sampling depth: Arable land - 30 cm Grasslands - 15 cm with removal of upper turf layer Hop-garden - 40 cm with removal of upper 10 cm layer Vineyards – sampling of two layers 0-30 and 30 -60 cm Intensive orchards - 30 cm. ‹#› 106 Soil sampling Choice of sampling device is based on the type of analysis (sampling probe, tube) (mg/kg) Depth of sampling – based on the goal of monitoring 0 - 5; 5 – 10 cm ....pesticides applied by spraying, ambient air 0 - 30; 30 – 60 cm ....(based on the depth of root systems) heavy metals, pesticide residua, xenobiotics, nutrients: N, P, K Average sample - 30 stabs (nicks) - lowland - 9,5 ha one sample - mountains - 6,5 ha Distribution of stabs should cover regularly whole area (cross the field) ‹#› 107 P1013132u P1013133u P1013122u P1013124u P1013139u Soil sampling ‹#› 108 Sampling scheme on the monitoring plot Široký šikmo nahoru no. 1 no. 2 no. 3 no. 4 individual sampling to get four composite samples 25 m 40 m soil pit PIC00002 ‹#› 109 Homogenisation, sieving, dividing of samples km100 s100 as200 pt100_comfortset S 17, kvartovací kříž Quarter cruise Dividing of sample Crushing, grinding, homogenization ras Sieving ‹#› 110 Basal soil monitoring program - setting the soil characteristics Unrepeated parameters monitored at establishing the monitoring plot Ärecording of the identification information of a monitoring plot Äsoil pit description Äanalyses of physical parameters (complete analyses of disturbed and undisturbed soil samples) Parameters monitored in six years period Äactive and exchangeable soil reaction Äcontents of available nutrients - P, K, Mg, Ca analysed by several methods Äcontents of microelements (B, Mo, Mn, Zn, Cu, Fe) Äsorption capacity (S, T, V) Äorganic matter content (Cox ) Ärisk element contents in nitric acid (As, Be, Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Pb, V, Zn) and aqua regia (Al, As, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Mo, Ni, P, Pb, V, Zn) extraction and total Hg content Yearly monitored parameters Äcontent of mineral nitrogen Ächosen microbiological and biochemical parameters Äcontents of selected organic pollutants (persistent organochloric pesticides, PCBs, PAHs, PCDDs/Fs) Äcontents of risk elements in plants on contaminated plots ‹#› 111 ÄPOPs bioaccumulate in animals because of their high lipid content and their long lifetimes ÄSome POPs bioconcentrate up food chains ÄChoice of species/matrix? ÄSpecies range and ecosystem differences ÄHigh variability in biological systems ÄBirds eggs; marine mammals Wildlife ‹#› 112 Human foodstuff Link between ‘environment’ and ‘exposure’ Many countries already have food sampling programmes Agricultural animals – wide distribution & ‘control’ - milk, eggs ühigh concentrations üclear AIR – GRASS – COW – FOOD link üeasily homogenised, pooled to represent a large area vBUT, also affected by husbandry practices EU milk monitoring, for source and exposure reduction ‹#› 113 Link between ‘environment’ and ‘exposure’ ‹#› 114 Human tissues Humans - truly global distribution, which allows complete spatial mapping of POPs in the global environment. Direct, integrated measurements of exposure – is the source and exposure reduction working ? Blood – variable but easy to sample; existing programmes ? Milk – babies are a key sub-group; better integrator? ‹#› 115 Úprava vzorků před extrakcí - sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací - přesítí přes síto s oky 2 mm (odstranění hrubého písku) (jíl je < 2um) - mletí nebo rozetření v misce - subvzorkování pro zachování homogenity - uchovávání v uzavřených prachovnicích - chránit před světlem a teplem ‹#› 116 Odběry sedimentů a odpadních kalů - vzorky s vysokým obsahem vody, nehomogenní, vyžadují zvláštní úpravu - odebírá se několik vzorků a promíchá se - podle hloubky odběru se dá usuzovat na stáří kontaminace - používají se drapákové vzorkovače a bagry pro vzorkování bez vertikální struktury - tyčové vzorkovače pro vzorkování profilu ‹#› 117 Úprava vzorků před extrakcí - odstranění kamenů a vody (dekantací) - sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací - rozemletí a separace frakce vhodné zrnitosti (<63um) - subvzorkování pro zachování homogenity - uchovávání v uzavřených prachovnicích - chránit před světlem a teplem - je možné uchovávat zmražený a extrahovat vlhký - pro odstranění síry se přidává prášková měď ‹#› 118 Odběr biotických vzorků - flóra - sběr, trhání nadzemních částí aspoň 3cm nad zemí - fauna - pasti, sítě, lov, vyhrabávání Vzorky jsou nestabilní, biologicky aktivní, s časem mění své složení. Chráníme je před vyšší teplotou a světlem, skladujeme ve vzduchotěsně uzavřených kontejnerech, zpracujeme co nejdříve. ‹#› 119 Úprava vzorku před extrakcí Rostlinné vzorky - usušíme (nejlépe lyofilizací) - rozetřeme v třecí misce, rozmixujeme - homogenizujeme Živočišné vzorky - lyofilizujeme - rozmixujeme, homogenizujeme - lze extrahovat bez sušení, s přídavkem síranu sodného ‹#› 120 SPMD - Semipermeable membrane device - selektivní vzorkovač organických polutantů - dialyzní vak nebo membrána, lipidická náplň - založeno na průniku látek polopropustnou membránou - jde o integrativní pasivní vzorkovač - selektivní pro lipofilní sloučeniny - vzorkuje pouze biodostupnou frakci - odhad distribuce mezi vodou a vzorkovačem: Kow - pro vzorkování vody, vzduchu, půd, kalů - nevýhoda: vztah mezi celkovým a biodostupným množstvím polutantů ‹#› 121 Techniky přípravy environmentálního vzorku Cílem je přenos analytu do jiné chemické fáze vhodné k analýze, odstranění interferentů a zakoncentrování. Hlavní techniky: - extrakce rozpouštědlem ( Soxhlet, Soxtec, mikrovlnná a ultrazvuková extrakce, superkritická fluidní extrakce) - extrakce a mikroextrakce na pevnou fázi (SPE, SPME) - separace na semipermeabilní membráně - analýza rovnovážné plynné fáze (head space) - kolonová kapalinová chromatografie - gelová permeační chromatografie ‹#› 122 ‹#› 123 Příprava vzorků ovzduší - filtry z odběrových zařízení jsou extrahovány organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Soxtec, ultrazvuková, mikrovlnná, superkritická extrakce) - čištění vzorků zahrnuje odstranění interferujících látek, které se extrahují spolu s analytem (např. rozkladem kyselinou sírovou) - frakcionace jednotlivých analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (silikagel, modifikovaný silikagel, florisil) - zakoncentrování ‹#› 124 ‹#› 125 Příprava vzorků vod - při vysoké koncentraci a čistotě je možná přímá analýza - extrakce - plynem (statický head space) - plynem se zakoncentrováním na sorbentu (dynamický head space, purge and trap) - kapalinou (rovnovážná distribuce) - na tuhou fázi (SPE, SPME) klíčový je výběr extrakčního sorbentu a elučního rozpouštědla ‹#› 126 ‹#› 127 ‹#› 128 Příprava vzorků půd a sedimentů - extrakce organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Soxtec, ultrazvuková, mikrovlnná, superkritická extrakce) - u sedimentů je nezbytné odstranění síry práškovou mědí - čištění vzorků (např. rozkladem kyselinou sírovou) - frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (silikagel, modifikovaný silikagel, florisil) - zakoncentrování ‹#› 129 Příprava biotických vzorků - extrakce organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Soxtec, ultrazvuková, mikrovlnná, superkritická extrakce) - čištění vzorků (např. rozkladem kyselinou sírovou) - odstranění vysikomolekulárních látek (lipidů) pomocí gelové permeační chromatografie - frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (silikagel, modifikovaný silikagel, florisil) - zakoncentrování ‹#› 130 Nejčastější techniky stanovení organických látek v environmentálních vzorcích jsou chromatografické: - GC - HPLC - CE - GC-MS, LC-MS - HRGC ‹#› 131 Chromatografie je fyzikální metoda separace, při které jsou separované sloučeniny distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární a druhá mobilní. Chromatografický proces probíhá díky opakované sorpci a desorpci sloučenin ve vzorku během kontaktu se stacionární fází. Separace sloučenin je způsobena rozdílností distribučních konstant jednotlivých sloučenin v daném separačním systému. Výsledkem tohoto procesu je rozdílná migrace chromatografovaných sloučenin. ‹#› 132 Chromatogram je grafickou prezentací odezvy detektoru na koncentraci analytů ve vzorku, slouží pro kvalitativní i kvantitativní hodnocení. Základním kvalitativním údajem je retence (retenční čas), závisí na chromatografované látce a chromatografickém systému, dává základní informaci o složení směsi. Pro identifikaci píků je třeba další informace, např. chromatografické standardy sledovaných látek. Pro kvantitativní stanovení se provádí odečet výšky nebo plochy píků, je třeba kalibrace systému. Kvalita systému se hodnotí mírou separace a účinností kolony. ‹#› 133 Klasifikace chromatografických technik podle: - skupenství mobilní fáze (GC, LC) - tvaru chromatografického lože (plošné, kolonové) - polarity chromatografického systému (normální, reverzní) - změny experimentálních podmínek (izokratické, gradient) - separačního děje (adsorpční, rozdělovací, iontoměničová, gelová, afinitní) - použití (analytická, preparativní) ‹#› 134 Plynová chromatografie - mobilní fází je plyn (inertní a dostatečně čistý, např. He) - stacionární fází je adsorbent s velkým povrchem nebo kapalina zakotvená na povrchu inertního nosiče - chromatografický děj probíhá na koloně (kolony náplňové a kapilární, různého průměru) - náplňové - modifikovaná stacionární fáze - kapilární kolony - úprava vnitřního povrchu křemenné kapiláry, deaktivace, chemická modifikace, smočení, imobilizace, síťování ‹#› 135 Instrumentace - zdroj nosného plynu (tlakové láhve, filtry) - pneumatický systém (regulátory tlaku a průtoku) - injektor (split, splitless, vyhřívání) - termostat kolony (gradientové programování teploty) - detektory - univerzální a selektivní - destruktivní a nedestruktivní - koncentrační a hmotové ‹#› 136 ‹#› 137 ‹#› 138 Typy GC detektorů - plamenový ionizační FID (hořící plamínek, elektrody) - selektivní na dusík a fosfor NPD (alkalický kov) - elektronového záchytu ECD (radioaktivní izotop, kolize) - tepelně vodivostní TCD, katarometr (žhavené vlákno) - plamenový fotometrický FPD - atomový emisní AED - fotoionizační PID - elektrický vodivostní ELCD ‹#› 139 ‹#› 140 ‹#› 141 ‹#› 142 ‹#› 143 Spojení GC s jinými technikami - GC-MS - GC-AED - GC-FTIR - vícerozměrná chromatografie (GC-GC) - vícemodální chromatografie (GC-LC) ‹#› 144 Kapalinová chromatografie - mobilní fází je kapalina, často směs různých rozpouštědel - stacionární fází je sorbent (nejčastěji chemicky modifikovaný silikagel, alumina, polymer, uhlík) - chromatografický děj probíhá na koloně - normální a reverzní uspořádání - eluce izokratická nebo gradientová - změna teploty, tlaku, složení mobilní fáze ‹#› 145 Instrumentace - filtrace a odplynění mobilní fáze - čerpadla mobilní fáze (regulátory tlaku a průtoku) - automatické dávkovače a injektory - termostat kolony - detektory ‹#› 146 ‹#› 147 Typy detektorů - fotometrické (měří se absorbance,UV, DAD) - luminiscenční (emise světla při přechodu molekuly z excitovaného do základního stavu, fluorescence a fosforescence) - elektrochemické (konduktometrické, amperometrické, coulometrické) - refraktometrické - hmotnostně spektrometrické ‹#› 148 Aplikace kapalinové chromatografie - podle použití - analytická - preparativní - podle fáze - normální - reverzní - podle interakcí - adsorpční - iontově výměnná (ionexy) - exkluzní (GPC- separace molekul na základě jejich velikosti a tvaru) - spojení s dalšími technikami - LC-MS - LC- NMR ‹#› 149 ‹#› 150 Další separační techniky - superkritická fluidní chromatografie - kapilární elektroforéza ‹#› 151 Základy hmotnostní spektrometrie - MS a NMR jsou dvě rozhodující techniky ve strukturní analýze - MS má výhodu jednoduchého spojení se separačními technikami - MS je destruktivní technika, molekuly jsou ionizovány odtržením elektronu (nevratný proces), vzniklý molekulární ion má hmotnost m a náboj z (měříme poměr m/z), je nestabilní a dále fragmentuje - ve spekru sledujeme molekulární ion i fragmenty ‹#› 152 Princip metody - separace ionizovaných moleku analyzované látky a jejích fragmentů podle velikosti poměru m/z (podle hmotnosti) - identifikace na základě distribuce hmotností molekulového ionu a vzniklých fragmentů - techniky - scan - SIM ‹#› 153 Instrumentace hmotnostní spektrometrie - iontový zdroj - pro ionizaci nárazem elektronu (tvrdá) - záchytem elektronu (negativní ion) - chemická ionizace (ionizuje se ionizační médium, např. methan, měkká technika) - FAB, API, FI, FD atd. - analyzátor - kvadrupólový - iontová past (trojrozměrný hyperbolický Q) - jednoduchá nebo vícenásobná fokusace - elektrické nebo magnetické pole - detektor - elektronový násobič - fotonásobič ‹#› 154 ‹#› 155 ‹#› 156 ‹#› 157 ‹#› 158 Spojení MS se separačními technikami - GC může být připojena přímo, kapilární kolona je vedena do iontového zdroje - u LC a CE je třeba odstranit nadbytek mobilní fáze, HPLC a MS musí být spojeno přes interface: - particle beam (PB,tryskový separátor těžších molekul) - thermospray (TSI,ionizace při vypařování ionů,měkká) - electrospray (ESI,) - APCI (ionty z mobilní fáze působí jako reakční plyn) ‹#› 159 Interpretace hmotnostních spekter Hmotnostní spektra zobrazují hmotnost molekuly a jejích fragmentů, obvykle jsou normalizovaná na největší pík ve spektru (base peak). Nejběžnějším typem jsou EI spektra (vzniklá ionizací nárazem elektronu při 70 eV).Existují knihovny hmotnostních spekter (Willey, NBS75). Postup: - zjištění molekulárního iontu (CI, snížení napětí EI) - dusíkové pravidlo - izotopický efekt - elementární složení - počet kruhů a dvojných vazeb - fragmentační pravidla ‹#› 160 ‹#› 161 ‹#› 162 ‹#› 163 ‹#› 164 Stanovení PAHs - extrakce rozpouštědlem (dichlormethan, chloroform, hexan-ether) např. v Soxhletově extraktoru - výtěžnost metody je třeba sledovat - nebezpečí kontaminace ze skla,solventů, sorbentů, - frakcionace kolonovou chromatografií na silikagelu (oddělení od více a méně polárních), eluce hexan-DCM - GPC pro biotu (oddělení vysokomolekulárních látek) - zakoncentrování,u těkavých pozor na ztráty odpařením - stanovení pomocí GC-MS (SIM) nebo HPLC (fluorescenční detekce) ‹#› 165 ‹#› 166 Stanovení PCBs - extrakce rozpouštědlem v Soxhletově extraktoru - nebezpečí kontaminace ze skla,solventů, sorbentů, vše je třeba předem čistit, včetně odběrových médií - frakcionace kolonovou chromatografií na modifikovaném silikagelu (kyselina sírová), spolu s pesticidy - koplanární PCB separujeme na kolonce s aktivním uhlím - GPC pro biotu (oddělení vysokomolekulárních látek) - zakoncentrování - stanovení pomocí GC-ECD, GC-MS (SIM) ‹#› 167 ‹#› 168 Stanovení organochlorových pesticidů - extrakce rozpouštědlem podle typu matrice (Soxhlet) - nebezpečí kontaminace ze skla,solventů, sorbentů - frakcionace kolonovou chromatografií na silikagelu modifikovaném kyselinou sírovou - driny a endosulfany se snadno rozkladaji, je nutná frakcionace na florisilu, hexan-ether(dichlormethan) - GPC pro oddělení vysokomolekulárních látek - zakoncentrování - stanovení pomocí GC-ECD, GC-MS (SIM, MS-MS) ‹#› 169 ‹#› 170 Stanovení PCDDs a PCDFs - extrakce rozpouštědlem podle typu matrice (Soxhlet) - extrakce tuků perkolací (s bezvodým síranem sodným) - zmýdelnění biologických vzorků alkalickou hydrolýzou s KOH a následná extrakce hexanem - čištění vzorků na kombinované koloně (silikagel modifikovaný postupně kyselinou sírovou, NaOH, dusičnanem stříbrným - frakcionace kolonovou chromatografií (florisil, alumina) - selektivní separace planárních sloučenin na aktivním uhlí ‹#› 171 Koncová analýza PCDDs/Fs - výhradně HRGC-HRMS - kapilární kolony 50-60m (DB-5, DB-17, DB-DIOXIN) - elektronová ionizace, negativní chemická ionizace - technika sledování vybraných iontů SIM - technika MS-MS u iontové pasti GC-MS ‹#› 172 Základy GLP a QA/QC - výsledky analýz mohou mít značné společenské důsledky, ovlivňovat závažná rozhodnutí - mohou vznikat pochybnosti o věrohodnosti údajů - požadavky na kontrolu kvality (validace a verifikace metod, kalibrace, analýza slepých a terénních vzorků, duplicitní a obohacené vzorky, referenční materiály, regulační diagramy, účast v mezilaboratorních testech) - akreditace a certifikace laboratoří, respektování GLP (předepsaná dokumentace, dodržování pravidel) ‹#› 173 QA/QC Zabezpečení jakosti (Quality assurance) je preventivní činnost (údržba, kalibrace, školení personálu) Řízení jakosti (Quality control) je kontrolní činnost - interní (slepé a obohacené vzorky, CRM) - externí (mezilaboratorní srovnávání a testy způsobilosti) ‹#› 174 Systém jakosti v laboratoři pro GC Základní údržba měřícího zařízení se provádí dle plánu údržby Základní kalibrační křivka je tvořena nejméně pěti koncentračními úrovněmi Při změně kalibračního roztoku se sleduje metrologická návaznost Kvantifikujeme pouze pro oblast lineární odezvy Každý 10. vzorek je kalibrační standard Kontrola čistoty skla a chemikálií S každou sérií se v laboratoři analyzuje slepý vzorek Obsah analytu ve slepém vzorku nesmí překročit 1/20 obsahu analytu ve vzorku Používá se referenční vzorek pro zjištění výtěžnosti metody Výtěžnost metody nesmí klesnout pod 50 % Enormně kontaminované vzorky se ředí tak, aby hodnota odezvy byla přibližné v ½ kalibrační křivky Pozitivní vzorky se konfirmují pomocí GC/MS Vedeme regulační diagramy MPZ a výměna vzorků s dalšími pracovišti Data v elektronické podobě se pravidelně archivují ‹#› 175 Kalibrace zavádí vztah mezi hodnotami udávanými měřícím systémem a hodnotami odpovídajícími obsahu analytu ve vzorku Mez detekce – nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno Mez stanovitelnosti - nejmenší množství analytu které může být stanoveno s přijatelným stupněm správnosti a shodnosti (např. pro chromatografii z poměru signál:šum mez detekce 3:1, mez stanovitelnosti 10:1) Citlivost – velikost nárůstu závisle proměnné vyvolaná nárůstem koncentrace analytu Linearita – vlastnost metody poskytnout výsledek zkoušky v určitém rozsahu přímo úměrné koncentraci Selektivita – stupeň nezávislosti na interferencích Specifičnost – vlastnost metody umožnit zjistit analyt v přítomnosti jiných složek ‹#› 176 Referenční materiál - látka o dostatečně určené vlastnosti tak, aby mohla být použita pro kalibraci Certifikovaný referenční materiál - referenční materiál vybavený certifikátem Přijatá referenční hodnota – odsouhlasená referenční hodnota pro porovnání Výtěžnost – podíl stanoveného množství analytu na jeho celkovém množství ve vzorku Přesnost ( accuracy ) je těsnost shody mezi výsledkem měření a přijatou referenční hodnotou Správnost ( trueness ) těsnost shody mezi průměrnou hodnotou a přijatou referenční hodnotou Shodnost ( precision ) těsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky získanými za definovaných podmínek ‹#› 177 Robustnost – vliv změn matrice na výsledek analytické zkoušky Opakovatelnost – nezávislé výsledky získané za stejných podmínek Střednědobá opakovatelnost – regulační diagramy Reprodukovatelnost – shodnost mezi laboratořemi např. z MPZ Vychýlení, odchylka, bias – rozdíl mezi střední hodnotou zkoušek a přijatou referenční hodnotou Systematická chyba výsledku se mění předvídatelným způsobem Náhodná chyba výsledku se mění nepředvídatelně ‹#› 178 Požadavky GLP na dokumentaci Vzorkování Laboratoř musí mít: - plán odběru vzorků - standardní pracovní postup pro odběr vzorků - dokumentace odběru vzorků ‹#› 179 Plán vzorkování Konkrétní způsob jednotlivých činností vedoucí k odběru reprezentativního vzorku (vzorek by měl v době zkoušek vykazovat stejné vlastnosti jako celý vzorkovaný objekt v časovém intervalu odběru vzorku ) Struktura plánu vzorkování Cíl vzorkování Definice místa odběrů, poznatky z místního šetření Rozsah ukazatelů a koncentračních hladin Požadovaný rozsah analýz, technika vzorkování Volba počtu, doby a četnosti odběru vzorků Zabezpečení jakosti vzorkování Volba analytických metod Ochrana zdraví a zásady bezpečnosti Požadavky na formu a způsob předávání výsledků ‹#› 180 Standardní pracovní postup Písemný návod detailně popisující provádění odběru vzorků Definuje použité vzorkovnice, způsob odběru vzorku, jeho konzervaci a homogenizaci Definuje podmínky přepravy vzorku Struktura standardního pracovního postupu Úvod Vymezení působnosti Oblast použití Definice pojmů, symbolů a zkratek Princip postupu Bezpečnost práce Přístroje a vybavení Pracovní postup Kontrola funkce přístrojů Vnitřní kontrola a řízení jakosti Četnost kontrol ‹#› 181 Titulní list SOP Název metody Číslo metody Řízený/neřizený výtisk Vypracoval Kontroloval Schválil Rozdělovník Datum platnosti Změny ‹#› 182 SOP – standardní operační postup 1.Úvod (všeobecné údaje, oblast použití, princip metody, terminologie, rušivé vlivy, omezení metody, bezpečnost při práci,toxikologické údaje, odpady a jejich likvidace) 2.Normativní odkazy 3.Chemikálie a spotřební materiál (roztoky, činidla, požadavky na jejich čistotu, příprava roztoků, příprava a uchovávání referenčních materiálů, požadavky na laboratorní sklo 4.Vzorkování (odběry vzorků, zásady odběru, plán odběru, podmínky transportu vzorku do laboratoře, konzervace vzorků, příprava k analýze 5.Přístroje a pomocná zařízení (příprava přístroje k měření, požadavky na metrologickou návaznost, kalibrační standard, regulační standard, CRM) ‹#› 183 6. Kalibrace 7. Postup zkoušky – analytické schéma 8. Kontrola kvality metody (interní kontrola- CRM, regulační diagramy, externí kontrola – MPZ, nejistota stanovení, validační protokol (většinou příloha SOP ) 9. Výpočet (vyhodnocení dat, vyjadřování výsledků) 10. Poznámky, doplňky, přílohy …. ‹#› 184 ‹#› 185 ‹#› 186 ‹#› 187