1 BiointerakceBiointerakce v rev reáálnlnéémm ččase?ase? klasickklasickéé metodymetody studia vzniku afinitnstudia vzniku afinitníích komplexch komplexůů vyuvyužžíívajvajíí znaznaččeneníí jednoho z partnerjednoho z partnerůů -- radioaktivita, fluorescence, enzymy,radioaktivita, fluorescence, enzymy, …… po smpo smíšíšeneníí interagujinteragujííccííchch biomolekulbiomolekul se nechse necháá ustavitustavit rovnovrovnovááha a stanovha a stanovíí se mnose množžstvstvíí volnvolnéé a va váázanzanéé znaznaččkyky -- celý pokus tedy poskytne na konci pouze jedencelý pokus tedy poskytne na konci pouze jeden úúdajdaj lze tak urlze tak urččit kinetickit kinetickéé rovnovrovnováážžnnéé konstantykonstanty poupoužžititíí biosensorbiosensorůů vychvycháázzíí z toho,z toho, žže jeden z partnere jeden z partnerůů jeje imobilizovimobilizováán v citlivn v citlivéé oblasti a moblasti a měřěřený signený signáál odpovl odpovííddáá mnomnožžstvstvíí vzniklvznikléého afinitnho afinitníího komplexuho komplexu -- nenneníí ttřřebaeba znaznaččeneníí mměřěřeneníí probprobííhháá prprůůbběžěžnněě v rev reáálnlnéémm ččasease lze urlze urččit kinetickit kinetickéé rychlostnrychlostníí konstantykonstanty ppřřevodnevodnííkem jsou nejkem jsou nejččastastěěji nelineji nelineáárnrníí optickoptickéé systsystéémymy Historie SPRHistorie SPR biosensorbiosensorůů konec 60. let:konec 60. let: KretchmanKretchman a Otto uka Otto ukáázali optickou excitacizali optickou excitaci povrchovýchpovrchových plazmonplazmonůů prostprostřřednictvednictvíím zeslabenm zeslabenééhoho tottotáálnlníího odrazu svho odrazu svěětlatla ATR,ATR, attenuatedattenuated totaltotal reflectionreflection -- druhou modruhou možžnostnostíí excitaceexcitace plazmonplazmonůů je pouje použžititíí difrakdifrakččnníí mmřříížžkyky 1983:1983: NylanderNylander aa LiedbergLiedberg ukukáázali vyuzali využžititíí SPR proSPR pro konstrukcikonstrukci biosensorbiosensorůů 19841984:: zalozaložžena spoleena společčnostnost Pharmacia Biosensor ABPharmacia Biosensor AB -- ccíílem vývoj a komercionalizace funklem vývoj a komercionalizace funkččnníího SPR systho SPR systéémumu 1990: prod1990: prodáán prvnn prvníí Biacore systBiacore systéém*m* 1994: uvedena na trh zjednodu1994: uvedena na trh zjednoduššenenáá verzeverze BIAliteBIAlite nnáásledovaly Biacore X, 2000, 3000, a Qsledovaly Biacore X, 2000, 3000, a Q 20052005: B: Biacoreiacore A100A100 ss dynamicdynamickoukou adresacadresacíí tokutoku reagencireagenciíí www.sprpages.nlwww.sprpages.nl ** LiedbergLiedberg, B. et al, B. et al.. Biosensing with surface plasmon resonanceBiosensing with surface plasmon resonance -- how it all started.how it all started. Biosens.BioelectronBiosens.Bioelectron.. 10: i10: i--ixix (1995)(1995) 2 SvSvěětlovodytlovody šíšířřeneníí paprsku vepaprsku ve svsvěětlovodutlovodu jjáádro (dro (corecore)) -- index lomu nindex lomu n11 plplášášťť ((claddingcladding)) -- nn22,, nn22> nn22/n/n11)) -- tottotáálnlníí vnitvnitřřnníí odrazodraz svsvěětla (TIR,tla (TIR, totaltotal internalinternal reflectionreflection)) vv optickyopticky řřididšíším prostm prostřřededíí vznikvznikáá superpozicsuperpozicíí dopadajdopadajííhoho a odra odráážženenéého svho svěětlatla elelektroektromamaggneticknetickáá vlnavlna propro biosensorybiosensory sese uplatuplatňňujujíí dva systdva systéémmyy -- planplanáárnrníí svsvěětlovodtlovod aa rozhranrozhraníí kov / dielektrikumkov / dielektrikum iinterakcnterakcee exponenciexponenciáálnlníí vlny s blvlny s blíízkým okolzkým okolíímm sensorusensoru mměěnníí podmpodmíínknkyy propro šíšířřeneníí svsvěětla v opticktla v optickéém systm systéémumu -- kvantifikujkvantifikujee sese dle zmdle změěn intenzity nebo fn intenzity nebo fáázovzovéého posunu svho posunu svěětlatla IOSIOS planplanáárnrníí vodivodičče sve svěětla (tla (integratedintegrated opticaloptical sensorsensor)) SPRSPR rezonancerezonance elmgelmg.. vlnyvlny šíšířřenenéé povrchovou vrstvou kovu (povrchovou vrstvou kovu (surfacesurface plasmon resonance, interakcplasmon resonance, interakcee s volnými elektrony v kovu)s volnými elektrony v kovu) 4 ExponenciExponenciáálnlníí vlnavlna zzááklademkladem biobiosensorsensorůů je interakceje interakce exponenciexponenciáálnlníí vlnyvlny s okols okolíímm energie vlny seenergie vlny se vprostvprostřřededíí velmi rychle utlumvelmi rychle utlumíí ((zhzhášášiviváá vlna)vlna) IOS SPRIOS SPR IOSIOS SPRSPR efektivnefektivníí index lomuindex lomu NN propro šíšířřeneníí vedenvedenéé vlny uvnitvlny uvnitřř optopt. syst. systéémumu -- ššíířříí se jeden definovanýse jeden definovaný modmod, který m, který máá u IOS magnetickou TMu IOS magnetickou TM00 aa elektrickou TEelektrickou TE00 slosložžku, u SPR existuje pouze TMku, u SPR existuje pouze TM00 zzmměěny v poli exp. vlny jsou vyvolanny v poli exp. vlny jsou vyvolanéé navnaváázzáánníímm biomolekulbiomolekul na citlivýna citlivý povrch (zmpovrch (změěny indexu lomuny indexu lomu nnCC v oblasti vzorku C)v oblasti vzorku C) ppenetraenetraččnníí hloubka exphloubka exp.. vlny vvlny v prostoru vzorku jeprostoru vzorku je ddPP -- ddalalšíší sousouččáásti syststi systéému jsou S podkladový substrmu jsou S podkladový substráát (obvykle sklo,t (obvykle sklo, nnSS =1.46)=1.46),, F jeF je planplanáárnrníí svsvěětlovodtlovod ((nnFF, tlou, tlouššťťkaka dd;; nnFF ≈≈ 2.0,2.0, dd = 80= 80 -- 120 nm, materi120 nm, materiáályly SiOSiO22/TiO/TiO22 nebo Sinebo Si33NN44)) uu SPRSPR jeje M tenkM tenkáá vrstvivrstviččka kovu (Au,ka kovu (Au, AgAg,, tltl.. 2020 -- 60 nm)60 nm) -- ppro vznik SPR je nutnro vznik SPR je nutnéé, aby u komplexn, aby u komplexníí dielektrickdielektrickéé permitivitypermitivity kovukovu εεMM ((εεMM == εεMM ′′ + j+ jεεMM "")) byla rebyla reáálnlnáá slosložžkaka εεMM ′′ zzáápornpornáá aa ––εεMM ′′ >> nnCC 22 C F d S x z dP C M d S dP exponenciální vlna 5 IOS / SPRIOS / SPR ppro efektivnro efektivníí indexy lomu N vedených vln a penetraindexy lomu N vedených vln a penetraččnníí hloubky plathloubky platíí:: IOSIOS:: N =N = kkxxλλ/(2/(2ππ)) ddPP == λλ/(2/(2ππ))[[NN 22 –– nnCC 22 ]] ––1/21/2 SPRSPR:: N =N = [[nnCC ––22 + 1/+ 1/εεMM]] ––1/21/2 ddPP == [λ[λ/(2/(2ππnnCCNN))]]((––εεMM ′′))1/21/2 vv ddůůsledku absorpce svsledku absorpce svěětla v kovu je navtla v kovu je navííc SPR jev velmic SPR jev velmi úúzcezce vymezen ve smvymezen ve směěru osy x na oblast efektivnru osy x na oblast efektivníí ddééllkyky LLαα (propaga(propagaččnníí):): LLαα == λλ((εεMM ′′))22 / (2/ (2ππNN 33 εεMM "" )) IOS a SPR jsou do znaIOS a SPR jsou do značčnnéé mmííry analogickry analogickéé systsystéémy, oba vyumy, oba využžíívajvajíí vedenvedeníí definovandefinovanéého modu vlnho modu vlněěnníí (bu(buďď tottotáálnlníím vnitm vnitřřnníím odrazemm odrazem veve svsvěětlovodutlovodu nebo podnebo podéél rozhranl rozhraníí kov / dielektrikum) a generovkov / dielektrikum) a generováánníí exponenciexponenciáálnlníí vlny vvlny v oblasti vzorku.oblasti vzorku. uu IOS jsou vedeny jak TEIOS jsou vedeny jak TE00 (s(s--polarizace), tak TMpolarizace), tak TM00 (p(p--polarizace)polarizace) u SPR existuje pouze TM slou SPR existuje pouze TM složžka (menka (menšíší mnomnožžstvstvíí informace !)informace !) vvedenedeníí svsvěětla u IOS je motla u IOS je možžnnéé aažž na vzdna vzdáálenost nlenost něěkolika cm, u SPRkolika cm, u SPR jen na Ljen na Lαα, p, přřitom citlivost jeitom citlivost je úúmměěrnrnáá prpráávvěě ddéélce drlce drááhy interakce sehy interakce se vzorkem.vzorkem. FyzikFyzikáálnlníí charakteristiky IOScharakteristiky IOS // SPRSPR Systém N dP Lα δN/δnC δN/δdF′ (nm) (µm) (10–4 nm–1 ) IOS TE0 1.68 98 – 0.12 3.1 TM0 1.55 126 – 0.26 4.8 SPR (TM0) Au 1.44 180 4 1.27 15.3 Ag 1.40 230 24 1.16 10.9 6 MMěřěřený signený signááll hhomogennomogenníí zmzměěna indexu lomuna indexu lomu celceléého prostho prostřřededíí CC ∆∆nnCC (pro(pro pufrpufryy jeje nnCC = 1.33)= 1.33) -- jako refraktometrjako refraktometr -- z hlediskaz hlediska sensorusensoru nenežžáádoucdoucíí ttvorba adsorbovanvorba adsorbovanéé vrstvy Fvrstvy F′′, je, je homogennhomogenníí, index lomu, index lomu nnFF′′ tloutlouššťťkkaa ddFF′′ ((pro bpro bíílkovinlkovinyy jeje nnFF′′ 1.451.45 –– 1.55 a1.55 a ddFF bývbýváá 44 –– 10 nm10 nm)) ppokud se oba jevy uplatnokud se oba jevy uplatníí sousouččasnasněě, lze celkovou zm, lze celkovou změěnunu vyjvyjááddřřit jako:it jako: ∆∆NN = (= (δδNN//δδnnCC))∆∆nnCC+(+(δδNN//δδddFF′′ ))∆∆ddFF′′ dF C F’ F (M) z x C F (M) adsorbovaná vrstva F’ změna indexu lomu okolního roztoku ppřřitom citlivost na zmitom citlivost na změěnu tlounu tlouššťťky adsorbovanky adsorbovanéé vrstvy je nepvrstvy je nepřříímomo úúmměěrnrnáá penetrapenetraččnníí hloubce:hloubce: ((δδNN//δδddFF′′ )) ≈≈ (1/(1/ddPP) () (δδNN//δδnnCC)) IOSIOS v souv souččasnosti vyrasnosti vyráábbíí MicroVacuumMicroVacuum v Mav Maďďarsku (OWLS)arsku (OWLS) pperiodiciteriodicitaa: 2400: 2400 linliniiíí/mm/mm hloubkahloubka: 10: 10--20 nm20 nm svsvěětlovodntlovodnáá vrstvavrstva tloutlouššťťkaka 200 nm200 nm indexindex lomulomu 11..88 materimateriááll: Si: SixxTiTi11--xxOO22 x=0x=0..2525±± 00..0505 sklenskleněěný substrný substráátt tloutlouššťťkaka 00..55 mm55 mm indexindex lomulomu 11..5353 OW 2400OW 2400 oopticalptical gratinggrating coupler waveguide sensorcoupler waveguide sensor L=48 mmL=48 mm 16 mm 16 mm ≈≈ 2 mm2 mm mmřříížžkaka 7 OWLSOWLS otootoččný stolek pro nalezenný stolek pro nalezeníí optimoptimáálnlníího pracovnho pracovnííhoho úúhluhlu SPRSPR ppro zavedenro zavedeníí svsvěětla se poutla se použžíívváá vstupnvstupníí hranol, povrchovhranol, povrchováá vlna se excitujevlna se excituje na rozhranna rozhraníí mezi kovem M a dielektrickou vrstvou C (vzorek)mezi kovem M a dielektrickou vrstvou C (vzorek) mmíísto hranolu lze principisto hranolu lze principiáálnlněě poupoužžíít i vstupnt i vstupníí mmřříížžku, vzhledem k rychlku, vzhledem k rychléémumu utlumenutlumeníí SPRSPR jevujevu nelze unelze užžíít výstupnt výstupníí uspouspořřááddáánníí zmzměěna rezonance se zaznamenna rezonance se zaznamenáá jako posun minima intensity pomocjako posun minima intensity pomocíí detektoru diodovdetektoru diodovéé pole (pole („„diodediode arrayarray““)) C vzorekC vzorek M kovM kov S podkladS podklad hranolhranol LED, laserLED, laser DADDADαα 8 SPR signSPR signááll úhel odrazu α Intensita odraž. paprsku vazebnvazebnáá reakcereakce =>=> zmzměěnana rezonanrezonanččnníích podmch podmííneknek resonanresonanččnníí úúhel odpovhel odpovíídajdajííccíí minimu intensityminimu intensity odraodražženenéého paprsku je kontinuho paprsku je kontinuáálnlněě vyhodnocovvyhodnocováán,n, jeho poloha jejeho poloha je úúmměěrnrnáá zmzměěnnáám povrchovm povrchovéé hmotnostihmotnosti vyvolaným adsorpcvyvolaným adsorpcíí biomolekulbiomolekul SPRSPR schschééma zma zááznamu signznamu signáálulu odraodražženenáá intenzitaintenzita úúhelhel θθ SPRSPR úúhelhel ččasas promytpromytíí pufrempufrem roztok antigenuroztok antigenu imobilizovanimobilizovanáá protilprotiláátkatka antigenantigen 9 SPRSPR biosensorbiosensor výměnný biosensor - „čip“ systému BIACORE modifikace povrchu: CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů, … Rozměry 9 x 2.5 x 0.1 cm BIAcoreBIAcore 30003000 20002000 počátkem 90. let minulého století uvedla na trh švédská firma Pharmacia (později Biacore, …, nyní součást GE Healthcare) 10 pozlacenpozlacenéé sklsklííččkoko prprůůtotoččnnáá celacela rotujrotujííccíí stolekstolek detektordetektor hranolhranol SPRSPR--44 systsystéém zm z KijevaKijeva SpreetaSpreeta koncem 90. let min. stoletkoncem 90. let min. stoletíí Texas InstrumentsTexas Instruments integrace optickintegrace optickéé mměřěřííccíí a elektronicka elektronickéé vyhodnocovacvyhodnocovacíí ččáásti do jedinsti do jedinéé sousouččáástkystky cm 11 SpreetaSpreeta schschééma uspoma uspořřááddáánníí (p(půůvodnvodníí verse)verse) zlatý povrchzlatý povrch sensorusensoru polarizerpolarizer LEDLED aa ššttěěrbinarbina svsvěětloprostupnýtloprostupný plastplast zrczrcáátkotko control box peristaltic pump inlet/outlet sample „black box“ PC - monitoring waste SpreetaSpreeta mměřěřííccíí uspouspořřááddáánníí box s elektronikoubox s elektronikou pumpapumpa vstup/výstupvstup/výstup optickoptickáá izolaceizolace 12 SpreetaSpreeta „„blackblack boxbox““ pumpapumpa odpadodpad bufferbuffer elektronikaelektronika SensiQSensiQ:: DiscoveryDiscovery manumanuáálnlníí 22--kankan. syst. systéém,m, relrel. vysoký. vysoký ššumum < 1 RU< 1 RU www.discoversensiq.comwww.discoversensiq.com ((doddodáávváá NomadicsNomadics)) 13 SensiQSensiQ 22--kankan.. mikrofluidnmikrofluidníí celacela ššum 0.25 RUum 0.25 RU sensorsensor SpreetaSpreeta 20002000 SensiQSensiQ 14 SensiQSensiQ PioneerPioneer automatizovanautomatizovanáá verzeverze 33--kankan. cela. cela momožžnostnost gradientovgradientovééhoho a dua duáálnlníího nho nááststřřikuiku ššum 0.1 RUum 0.1 RU ReichertReichert: SR7000 a SR700DC: SR7000 a SR700DC ruruččnníí jednokanjednokanáálovýlový a automatizovaný 2a automatizovaný 2--kankanáálový SPRlový SPR modulmoduláárnrníí design, prdesign, průůtotoččnnáá a staticka statickáá celacela -- momožžnostnost recirkulacerecirkulace vzorkuvzorku -- nastnastřřííkne se do cely a pak sekne se do cely a pak se relrel.. velkou rychlostvelkou rychlostíí (500(500 ulul/min) pohybuje/min) pohybuje -- ččipyipy -- smsmíšíšenenéé PEG/PEGPEG/PEG--COOHCOOH SAM s nSAM s níízkou nespec. vazbouzkou nespec. vazbou www.reichertspr.comwww.reichertspr.com 15 Reichert: SR700DCReichert: SR700DC SierraSierra SensorsSensors: SPR2: SPR2 sensoremsensorem je pje přříímo zlatem potamo zlatem potažžený hranolený hranol prostor cely lzeprostor cely lze sledovasledova minikamerou (bublinyminikamerou (bubliny……)) www.sierrasensors.comwww.sierrasensors.com 16 SensiaSensia:: betaSPRbetaSPR BioRad:BioRad: ProteOnProteOn XPR 36XPR 36 36 interak36 interakččnníích zch zóónn -- 66 ligandligandůů x 6 vzorkx 6 vzorkůů, 42 referen, 42 referenččnníích zch zóónn -- ppřřeklopitelneklopitelnáá prprůůtotoččnnáá cela, CCD kameracela, CCD kamera marketingovmarketingováá strategiestrategie -- proteomikaproteomika www.biowww.bio--rad.comrad.com 17 HoribaHoriba:: SPRiSPRi ((imagingimaging)) SPRiSPRi--LabLab+ a+ a SPRiSPRi--PlexPlex 64 (50064 (500 µµm)m) aažž 400 (200400 (200µµm)m) mměěr. bodr. bodůů ((spotsspots) na) na 11 cmcm22 plochyplochy ččipuipu -- hranol s pozlaceným povrchem, aktivovanýhranol s pozlaceným povrchem, aktivovaný ninižžšíší citlivost doporucitlivost doporuččenenéé koncentrace vzorkkoncentrace vzorkůů 150 ng/ml150 ng/ml (100(100--1000 kDa)1000 kDa) aažž 55 µµgg/ml (4/ml (4--20 kDa)20 kDa) výhoda: vysoce paralelnvýhoda: vysoce paralelníí mměřěřeneníí nutnost zvlnutnost zvláádnout cdnout cíílenou imobilizacilenou imobilizaci bioligandbioligandůů FujiFilmFujiFilm: AP: AP--30003000 unikunikáátntníí sensorsensor ve formve forměě tytyččinky (SPRinky (SPR stickstick)) „„nejrychlejnejrychlejší“ší“,, screeningscreening aažž 3840 vzork3840 vzorkůů za denza den mměřěřeneníí ppřři zastaveni zastavenéém tokum toku lokalizovanlokalizovanéé SPRSPR mikropormikroporééznzníí strukturastruktura referencereference …… nnááststřřik vzorkuik vzorku …… interakceinterakce 18 ResonanResonanččnníí zrczrcáátkotko -- IAsysIAsys TIRTIR hranicehranice exponenciexponenciáálnlníí vlnavlna povrch pro imobilizacipovrch pro imobilizaci resonanresonanččnníí vrstvavrstva (n(n vysokývysoký)) spojovacspojovacíí vrstvavrstva (n(n nníízkýzký)) == resonanresonanččnníí strukturastruktura odraodražženenéé svsvěětlotlodopadajdopadajííccíí ∅ hranolhranol ResonanResonanččnníí zrczrcáátkotko -- signsignááll Mod: TM TE úhel odrazu α Intensita odraž. paprsku VazebnVazebnáá reakcereakce =>=> zmzměěnana resonanresonanččnníích podmch podmííneknek rezonanrezonanččnníí úúhel odpovhel odpovíídajdajííccíí maximu intensity odramaximu intensity odražženenéého paprsku (el. aho paprsku (el. a magnmagn. slo. složžky) je prky) je průůbběžěžnněě sledovsledováán, jeho poloha jen, jeho poloha je úúmměěrnrnáá zmzměěnnáámm povrchovpovrchovéé hmotnostihmotnosti 19 ResonanResonanččnníí zrczrcáátkotko -- sensorsensor výmvýměěnnnnáá mměřěřííccíí kyvetakyveta systsystéémumu IAsysIAsys CitlivCitlivéé povrchy:povrchy: aminosilanizaminosilanizovanýovaný,, kkarboxylarboxylovanýovaný,, kkarboxymethylarboxymethyl--dextrandextranovýový,, hydrohydroffobobnníí,, biotinylbiotinylovanýovaný RozmRozměěryry 5 x 2 x 3 cm5 x 2 x 3 cm vibravibraččnníí mmííchadlochadlo hranol mměřěřííccíí prostorprostor rezonrezon. zrcadlo. zrcadlo nníízký nzký n llaseraser ddeteetekktortor rezonovanýrezonovaný hhνν spojovacspojovacíí vrstvavrstva polarizapolarizaččnníí hranolhranol RIFSRIFS -- reflereflekktometrictometrickkáá interfereninterferenččnníí sspektroskoppektroskopieie iinterferennterferenččnníí vrstvyvrstvy dopadající světlo I1 ∆φ∆φ = 2nd/= 2nd/λλ ++ φφ 400 λ 700 IndexIndex lomulomu nn I2 odraodražženenéé paprsky interferujpaprsky interferujíí reflekreflekččnníí spektrum mspektrum měěnníí tvar potvar po navnaváázzáánníí biomolekulbiomolekul rozlirozliššeneníí zmzměěny tlouny tlouššťťkyky 1 pm1 pm 20 BiacoreBiacore variantyvarianty nynnyníí (2010) dostupn(2010) dostupnéé:: 40004000 (A100)(A100) -- nejvynejvyššíšší produktivita, aproduktivita, ažž 4800 interakc4800 interakcíí/den/den T100T100 -- nejvynejvyššíšší citlivostcitlivost X100X100 -- osobnosobníí systsystéémm CC -- mměřěřeneníí koncentrackoncentracíí, certifikovaný provoz, certifikovaný provoz 30003000 -- univerzuniverzáálnlníí, citlivý, lze, citlivý, lze eluovateluovat pro MALDI/MSpro MALDI/MS QQ -- kvalita / kvantita v analýze potravinkvalita / kvantita v analýze potravin JJ -- nejjednodunejjednoduššíšší jednokanjednokanáálovýlový systsystéémm PorovnPorovnáánníí systsystéémmůů 21 T100T100 40004000 22 BIAcoreBIAcore 30003000 20002000 počátkem 90. let minulého století uvedla na trh švédská firma Pharmacia (později Biacore, …, nyní součást GE Healthcare) BIAcoreBIAcore -- automatizaceautomatizace ddáávkovavkovačč vzorkvzorkůů s pozicemi pro zs pozicemi pro záásobnsobnííkyky 23 SPRSPR biosensorbiosensor výměnný biosensor - „čip“ systému BIACORE modifikace povrchu: CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů, … Rozměry 9 x 2.5 x 0.1 cm ZasunutZasunutíí ččipuipu 24 Pohled dovnitPohled dovnitřř SpojenSpojeníí ččipu s IFCipu s IFC 25 BIAcoreBIAcore -- prprůůtotoččný systný systéémm microfluidicsmicrofluidics system IFCsystem IFC -- miniaturnminiaturníí výmvýměěnný modul s pneumatickynný modul s pneumaticky ovlovláádanýmidanými mikroventilymikroventily, d, dáávkovacvkovacíími smymi smyččkami a drkami a drááhamihami ppřříívodvod pracovnpracovnííhoho pufrupufru, reagenci, reagenciíí a vzorka vzorkůů k jednotlivým kank jednotlivým kanáállůůmm variabilnvariabilníí nastavennastaveníí mměřěřííccíí konfigurace prkonfigurace průůtotoččnnéé celycely -- 1 a1 ažž 44 kankanáálovlovéé mměřěřeneníí PrPrůůtotoččnnéé celycely klasickýklasický (2000, 3000)(2000, 3000) sekvensekvenččnníí / paraleln/ paralelníí hydrodynamickhydrodynamickáá adresace (A100)adresace (A100) 26 PrPrůůtotoččný systný systéémm ppřříímý nmý nááststřřik do celyik do cely nnááststřřik pik přřes smyes smyččkuku Detail toku v celeDetail toku v cele zpzpůůsoby prsoby průůtoku:toku: -- individuindividuáálnlníím kanm kanáálem (FCi)lem (FCi) -- dvdvěěma (FC1,2 nebo FC3,4)ma (FC1,2 nebo FC3,4) -- ttřřemi (FC1,2,3) nebo vemi (FC1,2,3) nebo vššemiemi vliv prvliv průůtotoččnnéé rychlosti narychlosti na výmvýměěnu obsahu celynu obsahu cely 27 PiezoelektrickPiezoelektrickéé biosensorybiosensory piezoelektrický efektpiezoelektrický efekt -- v nv něěkterých anisotropnkterých anisotropnííchch krystalech (kkrystalech (křřemen, turmalemen, turmalíín, Rochellova sn, Rochellova sůůl) se pl) se přřii mechanickmechanickéém namm namááhháánníí generujgenerujíí orientovanorientovanéé dipdipóóly aly a vznikvznikáá elektrickelektrickéé napnapěěttíí nnaopakaopak,, pokud se na krystal ppokud se na krystal přřivede stivede střříídavdavéé elektrickelektrickéé napnapěěttíí o vhodno vhodnéé ((rezonanrezonanččnníí) frekvenci, za) frekvenci, začčne krystal sene krystal se stejnou frekvencstejnou frekvencíí vibrovat, pvibrovat, přřitom se pitom se přřeveváážžnnáá ččáástst energie (105:1) uchovenergie (105:1) uchováá v oscilujv oscilujííccíím systm systéému amu a nerozptyluje se do okolnerozptyluje se do okolíí PPiezoiezoelektrickelektrickéé materimateriáályly oorientace piezoelektrickrientace piezoelektrickéé destidestiččkyky anisotropnanisotropníích materich materiáállůů jsou elektrickjsou elektrickéé, mechanick, mechanickéé a magneticka magnetickéé vlastnostivlastnosti rrůůznznéé vzhledem kvzhledem k rrůůzným oszným osáámm mmechanickechanickéé deformacedeformace:: destidestiččkaka diskdisk dd3131 ddéélkovlkováá radiradiáálnlníí dd3232 šíšířřkovkováá dd3333 tloutlouššťťkovkováá tloutlouššťťkovkováá y (3) x (1) z (2) el. pole osa (index) ppřříírodnrodníí: monokrystaly k: monokrystaly křřemene, z nich se pemene, z nich se přřipravipravíí vlastnvlastníí sensory jakosensory jako destidestiččky vyky vyřřezanezanéé pod ppod přřesnýmesným úúhlem (hlem (řřezy AT, BT, ST, ...)ezy AT, BT, ST, ...) umuměělléé: (dnes i k: (dnes i křřemen) keramika: polykrystalickemen) keramika: polykrystalickáá, ale uniaxi, ale uniaxiáálnlníí (orientovan(orientovanéé), p), přřííprava sintrovprava sintrováánníím (ZnO, LiNbOm (ZnO, LiNbO33, LiTaO, LiTaO33, Bi, Bi1212GeOGeO2020),), snadnsnadnéé tvarovtvarováánníí a nana nanášášeneníí plastyplasty: polyvinylidenfluorid PVDF (: polyvinylidenfluorid PVDF (--CHCH22CFCF22 --))nn -- smsměěs (asi 1:1) amorfns (asi 1:1) amorfníí a polykrystalicka polykrystalickéé formy, z nepolformy, z nepoláárnrníí nnááhodnhodněě orientovanorientovanéé a pola poláárnrníí orientovanorientovanéé slosložžky)ky) 28 VibraceVibrace piezosensorpiezosensorůů QCM quartz crystal microbalance; SAW surface acoustic wave; SHQCM quartz crystal microbalance; SAW surface acoustic wave; SH--APM shearAPM shear horizontal acoustic plate mode FPW flexural plate (Lamb) wave.horizontal acoustic plate mode FPW flexural plate (Lamb) wave. ooscilace mscilace můžůže probe probííhat vhat v celceléém objemu materim objemu materiáálu, nebo pouze vlu, nebo pouze v povrchovpovrchovéé vrstvvrstvěě.. KonkrKonkréétntníí systsystéémy jsou uvedeny na obrmy jsou uvedeny na obráázkuzku;; ččasto se uplatasto se uplatňňuje nuje něěkolik druhkolik druhůů oscilacoscilacíí sousouččasnasněě.. SAWQCM SH-APM FPW PiezosensoryPiezosensory -- chemickchemickéé mikrovmikrováážžkyky objemovobjemováá aakkusticustickkáá vlnavlna -- schschéémmaa tloutlouššťťkovkovéé ststřřihovihovéé vibracevibrace zzáákladnkladníí stastavv // amplitudamplitudaa HmotnostnHmotnostníí citlivostcitlivost:: QCMQCM -- quartz crystalquartz crystal microbalancemicrobalance drdržžáákk kontaktykontakty destidestiččkaka z kz křřemeneemene kovovkovovéé eleelekktrodtrodyy Piezoelektrický krystal ATAT--řřezez 55 aažž 2020 MHzMHz ∆f = -2f ∆m 2 0 A ρqµq 29 MMěřěřííccíí uspouspořřááddáánníí počítač čítač (měřič frekvence) oscilační obvod vzorekvzorek pumpapumpa odpadodpad prprůůtotoččnnáá cela s krystalemcela s krystalem UkUkáázka mzka měřěřííccíí aparaturyaparatury ččíítatačč peristalticperistaltickkáá pumppumpaa prprůůtotoččnnáá celacela s krystalems krystalem 30 OscilaOscilaččnníí obvodobvod schschééma hradlovma hradlovéého oscilho osciláátorutoru TANK1 VCC TANK2 XTAL1 GND1 XTAL2 FFQ NC FFD F NC VCC' F F ' GND2 F ' U1 74LS320 OUTPUT C1 L1 C 16 15 14 1 2 3 7 8 +5V Q Piezosensory v kapalinPiezosensory v kapalinááchch ppřři navi naváázzáánníí lláátky na aktivntky na aktivníí povrch elektrod dojde ke zmpovrch elektrod dojde ke změěnněě resonanresonanččnníí frekvencefrekvence ff00 zzmměěnníí sese hmotnosthmotnost celceléého systho systéému a vibrace se zpomalmu a vibrace se zpomalíí -- frekvencefrekvence poklesnepoklesne ppokud krystal osciluje navokud krystal osciluje navííc vpc vpřříítomnosti kapaliny, dochtomnosti kapaliny, docháázzíí k dalk dalšíšímm zmzměěnnáámm ff00 v dv důůsledku tlumensledku tlumeníí oscilacoscilacíí ((viskozitaviskozita prostprostřřededíí).). viskozitahmotnost =∆ ∆2 =∆ 3 0 2 0 qq LL qq µπρ ρη ff µρA mf f 31 TlumenTlumeníí v kapalinv kapalinááchch prostup vlny v kapalinprostup vlny v kapaliněě -- penetrapenetraččnníí hloubkahloubka δδ cca 180 nm pro vodu a 10 MHzcca 180 nm pro vodu a 10 MHz frekvencifrekvenci πρ η ωρ η δ f == 2 KomerKomerččnníí systsystéémymy Firma / kontakt Produkt / popis Akubio, Cambridge, GB (http://www.akubio.com) Resonant Acoustic Profiling – technologie založená na piezokrystalech, plánován měřící systém vhodný pro studium biointerakcí a aplikace ve farmaceutickém průmyslu, ve vývoji Elchema, Potsdam, NY, USA (http://www.elchema.com) řada modelů, 10 MHz krystaly, převodník frekvence-napětí a analogový výstup, elektrochemická měření základní EQCN 420 – rozlišení 0.1 ng (cca 0.1 Hz) 5000 USD, nejvyšší EQCN 900 – včetně impedančního měření, 24000 USD Elbatech, Marciana, Itálie (http://www.elbatech.com) QCMagic, krystaly 10 MHz, čítačem je PCI karta, rozlišení 1 Hz, až 4-kanálový CH Instruments, Austin, TX, USA (http://chinstruments.com) Model 400, Time-Resolved Electrochemical Quartz Crystal Microbalance, specializované pro elektrochemické experimenty, 8 MHz krystaly, rozlišení lepší než 0.1 Hz Initium, Tokio, Japonsko (http://www.initium2000.com) Affinix Q, 27 MHz krystaly, míchaná komůrka, spec. na biointerakce, také 4-kanálová varianta Maxtek, Santa Fe Springs, CA (http://www.maxtekinc.com) Research Quartz Crystal Microbalance, zaměřeno na elektrochemické pokovování, velké krystaly 4 až 10 MHz, rozlišení 0.03 Hz, až tříkanálový Princeton Applied Research / AMETEK , Oak Ridge, TN, USA (www.princetonappliedresearch.com) QCM 922 – 9 MHz krystaly, rozlišení 0.1 Hz, současně měří i resistanci krystalu, vyvinuto spolu s firmou Seiko QCM lab, Järfälla, Švédsko (http://www.qcmlab.com) QCM 3 – rozlišení 1 Hz (klasický čítač), současně měří i proud tekoucí krystalem (resistance), duální oscilátor, široký rozsah teplot (-200 až 500 °C) Q-Sense, Västra Frölunda, Švédsko (http://www.q-sense.com) D-300 - krystaly 5 MHz, rozlišení 0.01 Hz, současně měří i disipační faktor – tlumení oscilací krystalu, stacionární uspořádání, temperace, vhodné i pro mikroskopická pozorování; E4 – čtyřkanálová průtočná varianta, obdobné parametry Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA (http://www.thinksrs.com) QCM100 – krystaly 5 MHz, výstup resistance, vyžaduje externí čítač Universal Sensors, Kinsale, Ireland (http://intel.ucc.ie/sensors/universal) PZ-105, krystaly 10 MHz, rozlišení 1 Hz, zastaralý model 32 Affinix QAffinix Q Affinix Q4Affinix Q4 vvíícekancekanáálovlovéé mměřěřeneníí 33 MU BrnoMU Brno PZ detector computer flow-through cell with PZ crystal sample qqA mf f µρ ∆ −=∆ 2 02 The change ∆f of the resonant frequency f0 of piezoelectric crystals is proportional to the mass change ∆m (Sauerbrey’s equation): pump waste Real-time recording of the resonant frequency changes DeteDetekktor MultiLabtor MultiLab portable piezoelectricportable piezoelectric detector, computerdetector, computer--controlledcontrolled highlyhighly sensitive andsensitive and rapid measurementsrapid measurements principleprinciple: output frequency from the oscillator: output frequency from the oscillator(1)(1) is subtractedis subtracted(5)(5) from a similar stable reference frequencyfrom a similar stable reference frequency generated by DDS(2)generated by DDS(2) thus obtained low frequency isthus obtained low frequency is filtrated(6),filtrated(6), converted toconverted to voltagevoltage(9)(9), filtrat, filtrated(10)ed(10) andand finaly converted to digital signalfinaly converted to digital signal using A/D(11)using A/D(11) the resolution isthe resolution is 0.05 Hz / 20 ms0.05 Hz / 20 ms 34 FlowFlow--cell designcell design 25 Hz 1 min Sample Bad cell (not shown) large internal volume - slow mixing Good cell, crystal fixation not constant Optimized cell, constant pressure on the crystal QCMQCM--DD mměřěříí sousouččasnasněě zmzměěnu resonannu resonanččnníí frekvence a tzv. disipafrekvence a tzv. disipaččnníí faktor Dfaktor D -- zzáávisvisíí na tlumenna tlumeníí oscilacoscilacíí 35 RigidRigidnníí aa vviscoelasticiscoelastickkéé vrstvyvrstvy tenký rigidntenký rigidníí film:film: hornhorníí i dolni dolníí povrch vibrujpovrch vibrujíí synchronnsynchronněě viskoelastický film:viskoelastický film: hornhorníí i dolni dolníí povrch vibrujpovrch vibrujíí ss ffáázovým posunemzovým posunem -- vvěěttšíší tlumentlumeníí,, „„vvěěttší“ší“ odezvyodezvy VVííce informacce informacíí z piezosensorz piezosensorůů?? mměřěřenenéé zmzměěny frekvence neodrny frekvence neodráážžíí pouze zmpouze změěny hmotnosti,ny hmotnosti, ale i struktury adherujale i struktury adherujííccíí vrstvyvrstvy potpotřřeba meba měřěřit dalit dalšíší parametry,parametry, úúmměěrnrnéé viskoelastickýmviskoelastickým zmzměěnnáám (tlumenm (tlumeníí)) disipadisipaččnníí faktor D (Qfaktor D (Q--Sens)Sens) resistance R (Seiko / PAR)resistance R (Seiko / PAR) energie dodenergie dodáávanvanáá krystalu z oscilakrystalu z oscilaččnníího obvodu (AGC,ho obvodu (AGC, auto gain control)auto gain control) impedanimpedanččnníí mměřěřeneníí 36 ImpedanImpedanččnníí charakteristikacharakteristika výsledkem je vvýsledkem je věěttšíší mnomnožžstvstvíí informacinformacíí o do děějjíích na povrchu krystalu ach na povrchu krystalu a vyvyššíšší spolehlivost mspolehlivost měřěřeneníí -- odliodliššeneníí hmotnostnhmotnostníích a viskozitnch a viskozitnííchch zmzměěnn 5.930 5.935 5.940 0 10 20 30 [fmin,|Z|min] |Z| (kΩ) -90 -45 0 45 90 Θ = 0 fS fP f (MHz) C0 R1 C1 L1 [fmax,|Z|max] Θ (º) paspasíívnvníí mměřěřííccíí metodametoda na krystal se pna krystal se přřivivááddíí promproměěnnnnáá frekvence afrekvence a sleduje se zmsleduje se změěnana velikosti impedancevelikosti impedance |Z||Z| a fa fáázový posunzový posun ΘΘ ImpedanImpedanččnníí mměřěřeneníí VCC CLOCK TC0 TC1 TC2 TC3 LOAD SDATA SCLK RESET FOUT ' GND ' AD7008AD7008 C2 C1 D +5V Q analog vstup digital výstup počítač OSC 50 MHz C3 R1 R2 D pomocpomocíí DDS syntDDS syntetizetizáátorutoru AD 7008AD 7008 37 ImpedanImpedanččnníí mměřěřeneníí SouSouččasnasnéé trendy afinitntrendy afinitníích biosensorch biosensorůů SPR systSPR systéémy jsou smmy jsou směřěřovováány dony do farmaceutickfarmaceutickéé oblastioblasti screeningscreening nových lnových láátek s potencitek s potenciáálnlněě vyuvyužžitelnýmiitelnými fyziologickými vlastnostmifyziologickými vlastnostmi ccíílovlovéé biomolekulybiomolekuly se imobilizujse imobilizujíí na povrchna povrch sensorusensoru aa sleduje se jejich interakce s vazebnými kandidsleduje se jejich interakce s vazebnými kandidáátyty bubuďď hotovhotovéé molekuly (nmolekuly (náároroččnnéé -- mnoho momnoho možžnostnostíí)) nebonebo „„knihovnyknihovny““ stavebnstavebníích fragmentch fragmentůů (p(páár set), z tr set), z těěchch reagujreagujííccíích se pak nch se pak nááslednsledněě vytvvytváářříí kompletnkompletníí molekulymolekuly