Sensorgram Absolute response (RU) Report points 1 * \+ 1 1 Relative response (RU) p Buffei Sample Buffer Regeneration Buffer Time ■ průběh typického vazebného experimentu ■ signál v čase při vazbě biomolekuly na imobilizovaný Ugand ■ tvořen specifickou interakcí a změnou indexu lomu protékajícího roztoku Stanovení koncentrace základní možnosti: přímé měření (se zesílením odezvy) inhibiční měření (kompetice v roztoku) kompetice na povrchu sensoru analyle ligand //////////////// Direct binding assay detecting motecute Lŕ = m analyte ■■■ ■■■■■ Inhibition a&say (solution com pc titionj analyto 1777777777777? /77777T77. /777777777777T7? 7777777777777777 © © Direct binding assay with enhancement Icompeting anelyle ^ 0 gnalytů W// /77777777777777? Surface competition assay Prime mereni nejčastější způsob stanovení koncentrace analytu ve vzorku vyhodnocovat lze buď rychlost vazby v počátku, nebo změnu signálu po ustálení zvolený způsob měření ovlivní analytické parametry stanovení rychlost, citlivost, limit detekce vícevrstevný (sendvičový) komplex zlepší citlivost (např. nanočástice) Response Binding// rate í Binding level Time Response Ccmcenlration Concentration Vliv affinity a ligandu ■ vyšší afinita umožní měřit nižší koncentrace analytu Response Concentration Response Concentration Inhibiční (kompetiční) stanovení ■ pro malé molekuly, jejichž přímá vazba by poskytla nízký signál ■ kalibrační závislosti v log závislosti pro osu x • signál vyvolá vazba pomocné Concm*niKn logfconcOTtration] detekční molekuly; její afinita a koncentrace ovlivní výrazně průběh stanovení _ Response Response \ Increasing afflwty \pf delecting molecule —^ X llicreasing\oncentralioiT\ Decreasing concentration / \ ŕsf detecting^molecule \ qf rinlprtinr) mnlftrailftNŕ \ ^—-ľľľ^r^^ !og[concentration] log [concentration] Přímé měření (bez kalibrace) ■ pokud není k dispozici standard, lze za podmínek difúzni limitace určit koncentraci analytu z rychlosti vazby (lineární oblast) se znalostí (přibližnou) difúzního koeficientu analytu ■ je potřeba vysoká hustota Ugandu, dostatečná velikost analytu (přes 5 kDa) a přiměřená afinita interakce ■ optimální je odezva 0.3-15 RU/s při 5 ul/min aspoň 30 s, to odpovídá asi 0.05-5 ug/ml Response Swswgram is linoar V / >v mass transport is limiting / >v 1 Mats transport hnita H _^--^^^^-b»»Äbb»b^b»bB lnt*rac(ion limifa observed binding ^^B^^^^"^"' ^| obMived t- rkdinfl Time Afinitní interakce • vznik afinitního komplexu na základě specifické interakce dvou biomolekul s komplementárními vazebnými doménami je základem všech procesů v živých systémech • experimentální studium interakcí mezi biomolekulami pomáhá objasnit vzájemné vztahy v biologických systémech • mimo klasické procesy studia af initních interakcí jsou nyní v biochemii a biologii stále častěji využívány moderní metodiky na bázi biosensorů • přínosem biosensorů je rychlost, pohodlnost a možnost přímého sledování interakce v reálném čase bez nutnosti značení Typy afinitních interakcí molekulární reakce mezi partnery: antigen protilátka hormon receptor léčiva receptor enzym kofaktor / substrát / inhibitor receptor mikroorganismus / buňka nukleová kyselina vazebná bílkovina nukleová kyselina komplementární řetězec Afinitní interakce Kinetické konstanty: ka... asociační rychlostní konstanta kd... disociační rychlostní konstanta KA = ka/kd asociační rovnovážná konstanta Rozdělení afinitních sensorů • vždy je jeden z afinitních partnerů imobilizován na povrchu převodníku; podle generování signálu se pak rozlišují: ■ přímé afinitní biosensory vznik biokomplexu je možné sledovat přímo v průběhu afinitní interakce (v reálném čase) jako převodníky slouží speciální optické světlovodné systémy, piezosensory nebo impedimetrická zařízení ■ nepřímé afinitní biosensory jeden z afinitních partnerů je vhodně označen, na konci interakce se pak stanoví množství značky navázané na povrchu sensoru podle typu značky (enzym nebo fluorofor) se použije převodník vhodný pro měření enzymové aktivity nebo fluorescence Schéma měření s biosensorem Charakterizace affinitnich reakcí proč měřit rychlostní kinetické konstanty? 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 t (s) t (s) všechny tyto interakce mají stejnou rovnovážnou konstantu, liší se rychlostními konstantami Kinetická analýza_ ■ kvantitativní charakterizace afinitních interakcí má základní význam pro řadu oblastí biochemie, biotechnologie i biologie ■ klasické metody pro měření afinity jsou obvykle založeny na smísení interagujících partnerů, dosažení rovnovážného stavu, separaci volných a vázaných molekul a kvantifikaci jednoho z partnerů ■ užívají se vhodné detekční značky - radioaktivita, fluorescence, enzymy ■ nezískají se kompletní kinetická data a navíc může dojít ke změnám nativní molekuly ■ nejvíce informací lze vždy získat při průběžném sledování vazebného děje pomocí biosensorů ■ jedna z interagujících látek - ligand - je navázána na povrchu citlivé oblasti vhodného fyzikálního sensoru ■ při specifické vazbě druhé látky se změní fyzikální charakteristiky citlivého povrchu, na které sensor reaguje změnou signálu ■ vazebnou interakci tak lze sledovat v reálném čase a přímo bez nutnosti používat značení. Uspořádání experimentu ■ nejčastěji používaná metoda studia bioafinitních interakcí je schématicky znázorněna na obrázku ■ jedna z reagujících látek (ligand L) je imobilizována na citlivém povrchu sensoru (I—) ■ druhá (receptor R) je přítomná v roztoku v koncentraci c, ta je obvykle během měření prakticky neměnná, např. při průtočném uspořádání ■ sleduje se tvorba komplexu RL: K l-L + R ■-, — |-LR kd ■ interakci popisují kinetické rychlostní konstanty ka (asociační) a kd (disociační). ■ rychlost tvorby komplexu je: ■ Po ustavení rovnováhy (d[RL]/df = 0) jsou koncentrace všech forem dány rovnovážnými konstantami KA resp. KD; platí pro ně vztahy KA = [RL]/([R][L] = kjk* KD = 1/KA. d[RL]/dt = ka [R][L] - kd [RL] |-ligand + receptor « r |- komplex měřený signál je úměrný množství vznikajícího komplexu u všech typů sensorů signál závisí na hmotnosti molekul navázaných na citlivý povrch Výpočet kinetických konstant výchozí signál Y0 se bere nulový vazebná kapacita Ymax povrchu je úměrná celkové změně signálu po obsazení všech přítomných molekul Ugandu L v průběhu vazby bude zbývající množství volného neobsazeného Ugandu L přímo úměrné rozdílu Ymax-Y množství navázaného partnera R je přímo úměrné Y: d[RL]/dř = dV7dř = kac(Y- Ymax) - kdY a další úpravou získat: d\7dř= kacYmax~(kac + kd)Y k určení kinetických parametrů z experimentálních závislostí Y na čase f lze použít dva odlišné postupy, linearizaci transformací nebo nelineární regresi Linearizace ■ experimentální závislost Y = f(t) se numerickou transformací (derivace) převede na tvar dY/dt=f(Y) ■ nově získaná závislost by měla být lineární tvaru dY/dt = a + bY ■ pro absolutní člen (úsek na ose y) platí a = ka cYmax, ■ pro směrnici b = -ka c - k& ■ pokud se provedou vazebná měření pro řadu koncentrací c volného partnera L, lze kinetické rychlostní konstanty kw frd jednoduše zjistit vynesením závislostí a, b na koncentraci c ■ na základě grafu směrnic se určí velikosti konstant a z grafu úseků vazebná kapacita v ' max • lineární transformace primárních naměřených dat bohužel vede také k transformaci chyb počítaných parametrů, a tak jsou kvalitní naměřené údaje částečně znehodnoceny... ■ v současnosti používána zřídka Ukázka použití ELSEVIER JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS Journal of Immunological Methods !76<|OS1) 1H-125 Characterization of monoclonal antibodies to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a piezoelectric quartz crystal microbalance in solution Petr Skládal J'b*, Maria Minunni Marco Mascini a, Vladimír Kolář c, Milan Fránek c 1—4 ffla/si/nsyti-i _,100 200 1 -——-1-—X 40 \\ 100 30 > 90 100 Bl8] (w/ml) * r 10 § B - | 5 — -*r Fig. 2. Expcrimcrila] tracings obtained during the flow oi solutions of the monoclonal antibody E2/G2 through (he cell with the APTS/GA/BSA/2.4-D modified piezoelectric crys tal. The individual curves were shifted vertically for belter resolution and the concentrations of lgG solutions l^ig/mJ) are indicated above the curves. In the inset ^raph, the Ire-quency changes ni the end of the IS rtiin binding period are plotted vs, corresponding lg<"i concentrations. *^ B6/C8 a s re/cio 10 natn . * Fig. 5. Experimental binding corves obtained from flow of the individual MAb suluiiuns DO /ig/ml) through the cell containing the APTS/GA/BSA/!,( D modified piezoelectric crystal. 0 90 100 190 200 t (Hi) Fig. 3. The results of transformations of the /-< curves (Pig. 2) (o the dependencies of (d//dr) on / (delails are explained in the text). The concentrations of IgG E2/G2 corresponding to the individual curves (symbols) are shown in the figure. *:a = 4540 ± 270 moi-'ls"1 kj - 7.89 x 1CT4 ± 8.5 x 10"5 s"1 0 50 100 Fig. 4. The dependence of slopes SL (a) and intercepts INT ( a) (parameter, characterizing the straight lines (d//dO vs. f from Fig. 3) on concentrations of the monoclonal antibody E2/G2. The error bars represent the calculated standard deviations. Nelineární regrese_ ■ je exaktnější postup vycházející z integrace rovnice výchozí podle času, to přímo vede k výrazu závislosti velikosti signálu V na čase t. YJgCYBm{l-&Lp[-(ka(*kd)t]} _kaC+kd_ ■ z jediného experimentu tak je možné určit přímo žádané kinetické konstanty (takto se používá zřídka) ■ pro usnadnění numerického výpočtu lze zavést Yeq, tj. velikost signálu při dosažení rovnovážného stavu: Yeq=KcY_ /(kac+kd)=cY_ /(c+KD)=KAcYmJ(c+K~i ■ rovnice pak přejde na tvar: Y=Yeq{l-exp[-(kac+kd)t]} dalšího zjednodušení výpočtu lze dosáhnout zavedením kobs = ka C + kd hodnoty kinetických rychlostních konstant pak lze určit vynesením kobs proti koncentraci volného vazebného partnera fľj ~ 771 ~ ~T Y=Yeq I U_exp(-/cofos t)\ nelineární regrese umožňuje vyhodnotit vazebné křivky tvořené ze dvou nezávislých kinetických interakcí (např. nespecifická adsorpce Ugandu), je možné uvažovat vliv nestability základní linie, lze korigovat změny signálu vyvolané výměnou pracovního roztoku po nástřiku vzorku dochází obvykle k výrazné změně indexu lomu okolního prostředí, které se projeví jako prudká změna signálu u optických sensorů, stejně působí změny viskozity u piezoelektrických sensorů nelineární regerese je univerzální, lze použít i tam, kde linearizace selhává nebo není principiálně použitelná vůbec Ukázka kinetické analýzy Studium interakce protilátky s imobilizovaným haptenem pomocí piezoelektrického biosensoru Interakce antigénu (imobiliz.) s fragmentem protilátky (scFv) 0 5 10 15 0 5 10 Time (min) Time (min) Biacore 3000, Ag imobilizován na čipy CM5 a CM3, interakční závislosti pro různé koncentrace protilátek ukázky průběhu interakčních křivek pro různé koncentrace protilátky (nM) Vyhodnocení ref. kanál 1 - BSA, povrchové hustoty antigénu (RU, v kanálu č.): CM3: 2 - 264, 3 - 920, 4 - 647; CM5: 2 - 1206, 3 - 513, 4 - 2550) průtočná rychlost 25 ul/min (bez vlivu) Ukázky nalezených kinetických konstant - v závislosti na použité konc. Ab (nezávislá regrese každé křivky použitím Scrubber2, Biaevaluate použit pro extrakci dat) Distribution of the fitted kt values according to [Ab] CM3 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) Distribution of the fitted ft values according to [Ab] CM3 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) Distribution of the fitted kt values according to [Ab] CMS chip with immobilized Ag (NHS/CDI) "íL_ Distribution of the fitted ft values according to [Ab] CMS chip with immobilized Ag (NHS/CDI) CM5 9 Výsledky: CM3: ka = 56300. ± 8300 I moľ1 s1 ka = (6.9 ± 1.5)-10"5 s-1 CM5: ka = 38000 ± 12000 I moľ1 s1 ka = (7.3 ± 1.8)-10-5 s-1 150 200 150 200 Disociační fáze interakce ■ po vytvoření komplexu LR na povrchu sensoru se z okolí odstraní volný receptor R a lze pozorovat zpětný rozpad (disociaci) komplexu na výchozí složky ■ kineticky tento proces odpovídá dříve uvedené rovnici dY7df = kacYmax-(kac + kd)Y ■ kde se položí [R] = c = 0, odtud pak plyne: dYIdt = -kdY ■ je-li výchozí množství komplexu LR na povrchu sensoru dáno signálem Ya, integrace vede ke vztahu: y = yaexp(-M; ■ z experimentální disociační křivky lze pak parametry kd a Ya určit nelineární regresí, případně po úpravě na rovnici přímky lineami regresí: lny = inya-v Interakce proteinu GP41 (imob.) a scFv protilátek (Spreeta)__ 40 ng/ml 20 15 10 5 B121 buffer Dissociation rate interaction curves constants determined from dissociation parts oť the Antibody in (»-') B12 0.0015 ± 0.0020 CI 2 0.00 0 39 ±0.00048 biotinylovaný protein gp41 byl imobilizován na Au sensor přes cystamin, glutaraldehyd a avidin Asociace fea(mol1ls1) středně rychlá 100 až 5-106 středně rychlá 100 až 5-106 středně rychlá 100 až 5-106 středně rychlá 100 až 5-106 rychlá >5-10"5 rychlá >5-10"5 rychlá >5-10"5 Disociace velmi rychlá «0.01 rychlá 0.001 až 0.01 středně rychlá 10"5 až 0.001 pomalá < 10"5 velmi rychlá «0.01 rychlá 0.001 až 0.01 středně rychlá 10"5 až 0.001 Tvar závislosti Způsoby určení konstant asociace => ka rovnováhy => Ka disociace příliš rychlá asociace => ka rovnováha => KA disociace => kd asociace => ka rovnováha nenastává disociace => kd asociace => ka rovnováha nenastává disociace příliš pomalá asociace příliš rychlá rovnováha => Ka disociace příliš rychlá asociace příliš rychlá rovnováha => Ka disociace => kd asociace příliš rychlá disociace => kd Kinetika u Biacore ukázky průběhu interakčních křivek pro různé kombinace hodnot rychlostních konstant Kinetika u BIACORE interakce imobilizované karbonátanhydrasy II (30 kDa) a acetozolamidu (222 Da) ka= 1.141 xlOM.mol-i.s-Ä°= 0.178 s"1 A + B AB 1.282 hl 1H SM 3» 3M Evaluation software: SCRUBBER-data layout CLAMP - kinetic calculation V praxi to bývá komplikovanější... ■ při disociaci Ugandu z povrchu sensoru se může někdy vyskytovat tzv. "rebinding,, -partner R se sice uvolní z komplexu LR, ale než se stačí dostat do volného roztoku, je zachycen jinými neobsazenými Ugandy L na povrchu nastává pokud je povrchová hustota Ugandu L vysoká (L je nízkomolekulární) nebo pokud biovrstva není monovrstvou a má větší tloušťku (imobilizace v dextranové matrici) projevem bývají velmi nízké hodnoty fcd oproti očekávání ■ při analýze interakcí protilátek (IgG) s imobilizovanými antigény se obvykle uvažuje stechiometrie interakce 1:1, nicméně při interakci s imobilizovanými hapteny (R) je možná i bivalentní vazba ■ různé orientace (nehomogenita) ligandu ■ transport látek z roztoku k sensoru ■ obvykle existuje na povrchu sensoru nemíchaná vrstva - mimo vlastní afinitní interakce je tedy nutné uvažovat difúzni transport partnera R ■ bude diskutováno v další části Jak získat dobrá data ■■■ ujasnit si předem, o co nám vlastně jde, kinetické parametry, nebo vůbec pochopení interakce? - plánovat předem experiment nebojme se sbírat data nejvyšší rychlostí (10x za 1 s) u Biacore - získáme dokonalejší popis interakce a lépe odlišíme přechodové fáze pro kinetiku je vhodné malé množství imobilizovaného Ugandu - zmenší se lokální úbytek vázané biomolekuly (depletion) a omezí se možné sterické problémy (molekuly ligandů si budou „zavazet") - nejlépe zkusit několik imobilizovaných hladin pro porovnání použít přiměřeně rozsáhlý rozsah koncentrací volného partnera - omezí se systematická chyba - měřit jednotlivé koncentrace v náhodném pořadí - na konci tu první ještě zopakovat - ověřit zachování vazebné kapacity a aktivity Ugandu - rozsah koncentrací přibližně od /CD/10 po "\0KD udržujme měřící systém v perfektním stavu - dodržovat intervaly údržby (Desorb, Sanitize) - kontrola komponent - filtrovat roztoky, kvalitní spotřební materiál další zásady ■■■ provádět komletní regeneraci pokud možno až k výchozí základní linii - při použití např. vysoké koncentrace nemusí být štandartní regenerace dostatečná - zopakovat ještě jednou - generovat data až do značného stavu saturace povrchu - omezí se možný „rebinding" při disociaci - uvolněná molekula se nemá kam znovu navázat - zaznamenat dostatečně dlouhé asociační a disociační křivky (zbytečně nespěchat...) - zvýší se šance dosažení rovnovážného stavu - alternativní vyhodnocení kinetických asociačních/disociačních rovnovážných konstant používat referenční kanál pro eliminaci změn indexu lomu roztoků („bulk changes") a nespecifické vazby - analyzovat diferenciální data ještě je třeba ■■■ ■ jak Ugand, tak volný vazebný partner by měly být - v čistém stavu (minimálně musí být známá koncentrace toho volného...) - je nutná i konformační homogenita (monomer - dimer - oligomery se budou chovat značně rozdílně...) - ušetříme si „vymýšlení" složitých interakčních modelů ■ nesnažit se „over analyse" naměřená data - pokud data mají odpovídat jednoduchému modelu, ale f itování nevychází, tak přidávání „korekčních" parametrů situaci matematicky samozřejmě zlepší, i když výsledná rovnice už nemá smysl z biologického hlediska... ■ porovnat různé imobilizační metodiky - různé způsoby kovalentní vazby Ugandu - např. vazba přes aminoskupiny je často náhodná a může vést k heterogenite imobilizovaného Ugandu - zkusit různé afinitní imobilizace (proteiny A / G / L) - různé „tágy" (biotin, His, GST,...) mohou poskytnout homogenní orientaci / vazbu Ugandu Problémy a jejich řešení Cause í ľ deviation Samploa are Chemically or GOnfOrrnat:OriaJly impure Sampas se-f associate or aggregate Multivalent interactions/avidity effects Chemical heterogeneity in ligand imposed by immobilisation procedure Mass transport etfecls/rebindtng CrowdsJter.C hindrance Mutton and depletion of analyle within sample plug Sample carry-over Matrix effecla. bulk retractive jnde* changes. instrument drift and injection noise Nonspecific binding of anialyte to surface pH or tempera Eure eflects Experimental nose Complex binding mechanism Possible solution FVity proleint Check proteins using analytical contr fugatinn Keep muniiKalcnt Ficjund ti sfjluliori Orienl Ihe mnmoDilifalfOo of Ihe ligand or use a capture step Use low surface densities and higi How rates Accouil far mass transport d^nng data analySrs Use low surface densities Use KlNj£CT and high flow rates* Ufie EXTRA CLEAN and WASH procedures' Match sample and runnmg buffers and set up a reference cell Use reference cell Equilibrate sample and running suffer Replicate and randomize samples Use numercal integration and global data analysis t-1-1-}--■-r 10 &0 1DÜ 100Ö 5000 Pro zopakování... rovnovážné konstanty ... KD nebo KA rychlostní asociační a disociační konstanty ka a kd A+B^ AB Kn= 1/Ka= [A][B] = u Ad '/Aa [AB] k a konstanty mají jednotky: kobs, fcON (s1) zdánlivá rychlostní nebo pseudo-prvního řádu rychlostní konstanta (koncentračně závislá) ka, kass, (M1 s1) kinetická asociační rychlostní konstanta ka , kaiss, kA (s1) kinetická disociační rychlostní konstanta KD (M) kinetická disociační rovnovážná konstanta (1/ /CA) KA (M1) kinetická asociační rovnovážná konstanta (1/ KD) také se někdy nazývá afinitní konstanta... Rovnováha -200 0 200 400 200 150 ■eq Time (se 100 50 když nastane, tak ji využijme! - nezávislé určení rovnovážné konstar v _ Ymax[B] eq= KD + [B] 0.001 0.01 0.1 [B] (m Srovnejme kn získané různě o _Y_ Y, = lYa- Y0]exp(-kMt) 1) z fitování disociační fáze interakčních křivek 0 5 10 15 Dissociation time (min) 2) z výnosu kobs proti koncentraci [B] při hodnocení asociačních fází křivek . °bř. ° (s-i) měly by vyjít shodné 0 20 40 [B] (nM) Co je „rebinding" ? -200 0 200 400 600 Time (sec) ■ vazebný partner B uvolněný při disociaci z komplexu |-ligand-B se místo úniku do roztoku a odplavení z cely zase naváže na nějaký volný ligand, co potká po cestě... - disociační konstanty ka vychází příliš nízké - chybné interpretování zdánlivě vyšší stability komplexu Jak omezit „rebinding' použít disociační data z rané fáze křivky, kdy jsou molekuly imobilizovaného Ugandu ještě vesměs obsazené - a nemohou tedy zpětně B navázat přidat do roztoku při disociaci volný Ugand - odchytí uvolněné B a zabrání jeho zpětné vazbě na imobilizovaný Ugand Dvoufázové asociace data mohou být přesně fitována uo s předpokladem existence dvou vazebných interakcí y Time (s) Yt = Y0 + ^Y^-exp(-kobs,t)) + A/2(1-exp(-lrobs2r)) Proč vzniká jjdvoufázovosť4 ? při interakci probíhají alespoň dva nezávislé vazebné děje nehomogenní vazebná místa imobilizovaného Ugandu - již před imobilizací - problém vzniklý při imobilizací - rozdílné orientace - sterické zábrany, mohou se prohloubit po vzniku komplexu nehomogennost partnera v roztoku - již před interakcí - při interakci - částečně nespecifická vazba, rebinding použít pouze počáteční část asociační fáze zkontrolovat hodnoty ka získané různě • • * Globální analýza všechna data z jednoho experimentu (různé koncentrace, asociační i disociační fáze) jsou fitována současně nalezené kinetické parametry tedy musí vyhovovat pokud možno všem naměřeným křivkám _Time (seconds)_ Pararneler Vawe Sld. Erroi association rale conslanl 1417399.1547 39392.985 dlssociatlon rate conatant 0.1884 0.005 Uoand capacttv 91.5476 1.321 Limitace látkovým transportem ■ nastává tehdy, pokud rychlost kinetiky interakce je shodná nebo vyšší než difúze volného partnera k povrchu sensoru ■ do modelu se musí zahrnout transportní člen where D is the diffusion coefficient of the analyte in m;/s f is the volumetric flow rote of liquid through the flow cell in mVs h, w, I are the flow cell dimensions I height, width, length in ml Detekce při globální analýze d) 1400 RU 500 RU 150 RU o 20 K 60 ?oo 400 600 0204010 200 400 600 0 M 40 60 200 400 600 Time (sec) Time {sec) Time (sec) ■ nastává 0 20 40 60 200 400 600 0 20 40 60 200 400 600 0 20 40 60 200 400 600 Time (sec) Time (sec) Time (sec) nenastává Kinetická „titrace" nestřídá se interakce a regenerační krok, ale interakce následují těsně za sebou hodnocení -globální analýza (program CLAMP) ■200 nM Time (s) 133-80' 60 4!> 20 0 200 nM —i— 200 —I— '100 -1— SCC Time (s) —I— 800 —I-1 1000 1200 I složené systémy lze „rozpočítat" Fig. 10. Kinetic titration analysis of complex systems. The interaction of 32-u with an antibody was tested at concentrations of 1, 4, 16. 64. and 128 nM. Each analyte concentration was injected over the surface at a flow rate of 30uIVmin for 120s. The plot shows ihc observed response data (shown in black) and the lit to a kinetic titration model for surface heterogeneity (shown in red). Based on the fit. the data consist of components I and 2 (deconvolved individual components are shown in green and purple). The refractive index (RI) correction applied to the lilted data set is indicated in orange al the bottom of the plot. Se vším pomůže software... Predefined models Models for simultaneous ka/kd 1:1 (Langmuir) binding 1:1 binding with drifting baseline 1:1 binding witb mass transfer Bivalent analyte Heterogeneous analyte (competing reactions) Heterogeneous ligand (parallel reactions) Two-state (conformational change) Models for separate ka/kd 1:1 (1.angmuir) association 1:1 (Langmuir) dissociation Models for general fitting 4-parameter equation Linear fit Solution affinity Steady state affinity Additionalmodels I: i binding with exponential baseline drift 1:1 binding witb mass transfer km(m/s) 1:1 Langmuir association (kobs) Average