1
EnzymovEnzymovéé sensorysensory
enzymy – bílkoviny s aktivním místem, v němž
je substrát přeměňován na produkt(y):
k1 k2
E + S ES E + P
k-1
Michaelisova konstanta Km = (k-1+k2)/k1
rychlost přeměny substrátu: v = vmax[S]/(Km+[S])
saturační závislost – kalibrace je lineární pouze
pokud platí [S] << Km pak v = vmax/Km[S]
MMěřěřeneníí koncentrace substrkoncentrace substráátutu
Stanovovaná látka je imobilizovaným enzymem konvertována
na produkty detekovatelné vhodným převodníkem
Obvykle je možné pro daný analyt navrhnout více konfigurací
biosensoru
Přehled:
Sacharidy
Alkoholy, fenoly
Karboxylové kyseliny, aminokyseliny
Dusíkaté sloučeniny
2
Sacharidy
glukosa
důležité měření v klinické praxi
(normální hladina v krvi 5 mM, v moči
1 mM) – potřebný rozsah 0.1 až 20 mM
glukosa oxidasa
(β-D-glukosa : O2 1-oxidoreduktasa,
EC 1.1.3.4, GOD), je běžně dostupná
z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum. GOD je dimer se
dvěma FAD kovalentně vázanými na podjednotky, obsahuje asi 16%
glykosylových zbytků, molekulová hmotnost je 160 kDa, specifická aktivita
komerčních preparátů přesahuje 200 IU/mg a je velmi stabilní.
PQQ-dependentní glukosa dehydrogenasa z bakterie Acinetobacter
calcoaceticus (EC 1.1.99.17, PQQ značí koenzym pyrolochinolinochinon);
snadno přenáší elektrony na mediátory (ferrocen), a má velmi vysoké
číslo přeměny - poskytuje nejvyšší signál.
GOD (podjednotka, FAD červeně)
BiosensoryBiosensory pro diabetikypro diabetiky
v oblasti klinické biochemické analýzy zůstává stále středem
zájmu měření hladiny glukosy u diabetiků
diabetes mellitus (cukrovka) a s ním spojené komplikace tvoří v
dnešní době velký sociální problém
kromě běžných poruch souvisejících s diabetem, jako je
hyperglykemie, metabolická acidóza a glykosurie, se u diabetiků
vyskytují i další komplikace, které výrazně ovlivňují kvalitu života
pacientůregulace je však u diabetiků porušena a musí se docílit
vnějším podáváním insulinu
dávkování však vyžaduje znalost aktuální hladiny glukosy, takže
pacienti jsou nuceni několikrát denně sami měřit glykemii
velmi dobré uplatnění biosensorů
3
DiabetesDiabetes mellitusmellitus (cukrovka)(cukrovka)
klinicky definován jako chronické, endokrinní a metabolické
onemocnění, vznikající v důsledku nedostatečného působení
insulinu
existují dva typy tohoto onemocnění:
1. typ neboli inzulín-dependentní diabetes mellitus (IDDM,
četnost 3 až 7 případů na tisíc osob) je charakterizován
sníženou nebo prakticky chybící produkcí inzulínu, takže
pacienti ho musí denně přijímat v injekčních dávkách.
2. typ je inzulín-independentní diabetes mellitus (NIDDM),
pacienti na vlastní nebo injekčně podaný inzulín nereagují
(rezistence).
vznik a vývoj komplikací při tomto onemocnění je velmi těsně
spjat s porušenou regulací hladiny krevní glukosy
Regulace hladiny glukosyRegulace hladiny glukosy
za normálních okolností je koncentrace glukosy v krvi udrožována mezi 4.4
a 6.6 mM pomocí zpětné vazby
nárůst koncentrace glukosy po jídle stimuluje rychlé uvnolnění insulinu, který
umožní vstup glukosy dovnitř buněk a současně zabrání její tvorbě v játrech
8 12 19 8 hod
snídaně oběd večeře spánek snídaně
15
10
5
0
glukóza
(mM)
hyperglykemie
diabetik
normální stav
hypoglykemie
Denní průběh hladin krevní glukózy
4
BiosensoryBiosensory pro diabetikypro diabetiky
první osobní glukometr na bázi
výměnného elektrochemického
biosensoru představila firma
MediSense
ExacTech - velikost psacího pera do
kterého se zasunovaly měřící pásky
na jedno použití
Companion - formát karty
MediSense nyní patří do skupiny
Abbott Laboratories, současný její
glukometr je distribuován pod
názvem Precision QID
proti předchozím verzím potřebuje
nyní pro analýzu pouze 5 mikrolitrů
krve, takže pacient je méně
zatěžován.
BiosensoryBiosensory pro diabetikypro diabetiky
elektrochemické sensory
Elite (pro analýzu stačí 3 mikrolitry krve) vyrábí japonské
firmy Matsushita a Kyoto Daiichi Kagaku, distribuje Bayer
Accu-Chek Advantage (Boehringer Mannheim) na rozdíl
od ostatních nevyužívá k výrobě biosensorů sítotisk, ale
originální vícevrstvou laminátovou technologii
reflektometrické systémy
Encore (Bayer),
One Touch (existuje ve verzích Basic a Profile), vyrábí
firma LifeScan patřící pod Johnson & Johnson)
Accu-Chek (verze Instant a Easy, Boehringer).
5
Srovnání formátu biosensorů
Hlavní cíl do budoucna
implantovatelný glukosový biosensor pro měření
in vivo
přímé řízení pumpy dávkující kontinuálně insulin
podle okamžité potřeby pacienta
výsledky vývoje prováděného paralelně asi na
desítce různých pracovišť v celém světě nadějné
- po implantaci fungují biosensory až 100 dnů
komerční systém dosud není k dispozici
problémy jsou zejména se spolehlivostí a
dostatečně dlouhou operační stabilitou.
6
Monosacharidy
galaktosa
monosacharid, potenciálně toxická při poruchách
odbourávání; hladina v séru normálně pod 0.25 mM
galaktosa oxidasa (EC 1.1.3.9, kuproprotein), má afinitu k
oběma anomerům
fruktosa
alternativní sladidlo v potravinářství
fruktosa dehydrogenasa - membránově vázaná, přenos
elektronů prostřednictvím cytochromů
kyselina askorbová (vitamin C)
v potravinách, ovoci, a mnoha vitaminových preparátech
askorbát oxidasa (EC 1.10.3.3, kuproprotein)
Disacharidysacharosa
disacharid, potravinářstvi, cukrovarnictví
multienzymové stanovení: hydrolyzuje se invertasou (EC 3.2.1.26) na α
anomer glukosy a fruktosu, poté se pomocí mutarotasy (EC 5.1.3.3)
urychluje ustavení rovnováhy mezi oběma anomery glukosy (spontánně
tento proces probíhá pomalu) a nakonec se β anomer glukosy oxiduje
glukosa oxidasou
laktosa (β-D-galaktosyl-4-O-glukosa)
mléčný cukr (0.3 až 0.6 mM v lidském a 0.25 až 0.28 mM v kravském
mléku), analýza v potravinářství - určení sušeného mléka v produktech
hydrolýza β-galaktosidasou (EC 3.2.1.23) poskytuje oba
monosacharidy, pak se použije buď galaktosa- nebo glukosa oxidasa
maltosa
hydrolýza maltasou (EC 3.2.1.20), poté se měří vzniklá glukosa
7
Polysacharidy
škrob (spojení glukosových molekul α-1,4)
funguje jako zásobní polysarcharid, stanovení se provádí v
obilí, rýži a bramborách
nejprve hydrolýza glukoamylasou (= amyloglukosidasa,
exo-1,4-α-glukosidasa, EC 3.2.1.3), navíc lze přidat i αamylasu
(1,4- α-D-glukan-glukanohydrolasa, EC 3.2.1.1),
která produkuje maltosu a dextriny délky 4 až 12
glukózových jednotek); nakonec se použije glukosa oxidasa
problémem je velikost molekuly škrobu, je vhodnější provést
hydrolysu v enzymovém reaktoru než imobilizovat
hydrolytické enzymy v biokatalytické vrstvě na povrchu
převodníku
Alkoholy
ethanol
v alkoholických nápojích, v klinické praxi a kontrola řidičů
alkohol oxidasa (EC 1.1.3.13, Pichia pastoris)
cholesterol
klinické praxe, v potravinách (tuky)
cholesterol oxidasa (EC 1.1.3.6, produkuje peroxid vodíku)
účinkuje na volný cholesterol; pro stanovení formy vázané
v esterech se přidá cholesterol esterhydrolasa (EC 3.1.1.13)
cholin
při studiu nervové funkce (neuromediátor)
cholin oxidasa (EC 1.1.3.17, z Alcaligenes sp.) produkuje
betain a dvě molekuly peroxidu vodíku
8
Fenoly
stanovení fenolů má značný význam v průmyslových
odpadních vodách a v některých potravinách (oleje)
tyrosinasa (fenol oxidasa nebo polyfenol oxidasa, EC
1.14.18.1) je kuproprotein izolovaný z žampionů, nebo
používaný přímo jako tkáňový řez houby
působí na fenol, jednoduché substituované fenoly, katechol,
chlorfenoly, oxidace jde přes katechol na o-chinon, který
spontánně polymeruje (tmavnutí enzymových vrstev)
dalším enzymem je lakasa (EC 1.10.3.2, izoluje se z houby
Polyporus versicolor, kuproprotein) působí zejmén na
hydrochinon a p-difenoly
některé kmeny Pseudomonas jsou schopné fenoly
metabolizovat (mikrobiální sensory)
Karboxylové kyseliny
kyselina mléčná (L-laktát)
v klinické medicíně (stanovení koncentrace v séru slouží pro rozlišení
příčin acidóz, normální hladina je 2.7 mM)
ve sportovní medicíně slouží jako ukazatel pro hodnocení trénovanosti
(nárůst koncentrace nastává jako reakce na fyzickou zátěž)
v potravinářském průmyslu vzniká při mléčném kvašení - jogurty, víno
L-laktát dehydrogenasa (EC 1.1.1.27, u savců, ze svalu) má jako
koenzym NAD+, pro analýzu biosensory se prakticky nepoužívá
další dehydrogenasou laktátu je cytochrom b2 (EC 1.1.2.3, izoluje se z
kvasinek nebo se používají přímo kvasinky), jeho akceptorem je ferrikyanid
a další mediátory
nejběžnější je dnes L-laktát oxidasa (EC 1.1.3.2, LOD, z bakterie
Pediococcus), flavoprotein produkující peroxid vodíku
L-laktát monooxygenasa (EC 1.13.12.4) produkuje acetát a oxid uhličitý a
používala se spíše dříve před objevením LOD.
při mléčném kvašení může vznikat i D-forma laktátu, její stanovení se
provádí pomocí D-laktát dehydrogenasy (NAD+dependentní).
9
kyselina jablečná (malát)
v ovoci a ve víně (hodnocení kvality), potřebný enzym je malát
dehydrogenasa (NAD+, EC 1.1.1.37)
kyselina šťavelová (oxalát)
v moči při hyperoxalurii; oxalát oxidasa (EC 1.2.3.4) katalyzuje reakci
(COOH)2 + O2 ——→ 2 CO2 + H2O2
kyselina isocitronová
produktem při fermentační výrobě kyseliny citronové, ke stanovení slouží
isocitrát dehydrogenasa (EC 1.1.1.42, NADP+)
kyselina močová (urát)
v klinické praxi - hematologické poruchy (v séru 0.14 až 0.4 mM). Enzym
urikasa (urát oxidasa, EC 1.7.3.3, obsahuje měď) ji oxiduje na allantoin:
HN
N N
N
O
O
O
H
HH
HN
N
O
O N
NH2
O
H H
Urikasa
+ O2 + H2O + CO2 + H2O2
mastné kyseliny
analyzují se v krvi, v potravinách indikují denaturaci tukových
(olejových) složek
stanovení je dvouenzymové: acyl-CoA synthasa v
přítomnosti ATP a CoA převede mastnou kyselinu na
příslušný acyl-CoA, na který účinkuje acyl-CoA oxidasa (EC
1.3.3.6, oxidací vzniká dvojná vazba a současně se produkuje
peroxid vodíku)
…….
kyselina siřičitá
obsah se kontroluje ve víně
její oxidace je možná pomocí sulfit oxidasy (EC 1.8.3.1)
produkující H2O2
10
Aminokyseliny
lze stanovit jako sumu (v potravinách) pomocí oxidasy L-aminokyselin
(EC 1.4.3.2), obdobný enzym existuje také pro D-aminokyseliny (EC
1.4.3.3), může se uplatnit při oxidaci glycinu
lyzin
jako esenciální faktor přidáván do krmných směsí
lyzin-a-oxidasa (EC 1.4.3.14, dekarboxylující, z Trichoderma viridae)
lyzin dekarboxylasa (EC 4.1.1.18, z E. coli, Bacterium cadaveris)
produkuje CO2 a kadaverin, ten lze následně stanovit diaminoxidasou (z
hrachu, EC 1.4.3.6)
kyselina glutamová
je součástí polévkových koření a sojové omáčky
glutamát oxidasa (EC 1.4.3.11, flavoprotein) produkuje z glutamátu NH3,
CO2, α-oxoglutarát a H2O2
glutamát dehydrogenasa [L-glutamát:NAD(P)+ oxidoreduktasa
(deaminující), z jater] se uplatňovala zejména dříve před objevením
oxidasy
Dusíkaté sloučeninymočovina
v krvi normální hladina 3.6 až 9 mM, indikátor funkce ledvin, ureasa (EC
3.5.1.5) je vůči močovině absolutně specifická
kreatin, kreatinin
enzymy potřebné pro stanovení kreatininu a kreatinu:
E1 kreatinin iminohydrolasa
(EC 3.5.4.21)
E2 kreatinin amidohydrolasa
(kreatinasa, EC 3.5.2.10)
E3 kreatin ami-dinohydrolasa
(EC 3.5.3.3)
E4 sarkosin oxidasa
(EC 1.5.3.1)
N
NH
O
N
+
H2
CH3
N
NH
O
OCH3
NH3+
COO
-
CH2N
CH3
H2N
H2N
COO
-
CH2NH
CH3
E2
E1 E3
E4
kreatinin kreatin
sarkosin
N-methylhydantoin
formaldehyd + glycin + H2O2
11
Purinové base (čerstvost rybího masa)
ATP
↓ ATPasa
ADP + Pi
↓ myokinasa
AMP + Pi
↓ AMP deaminasa
IMP + NH3
↓ 5´-nukleotidasa
inosin + Pi
↓ nukleosid
fosforylasa
hypoxanthin + ribosa-1-Pi
↓ xanthin OD
xanthin
↓ xanthin OD
kyselina močová
Při kažení masa probíhá enzymová autolýza tkáně a
dochází k postupnému hydrolytickému rozkladu ATP,
v konečné fázi se oxiduje až na kyselinu močovou.
Tím nastávají změny kvality a chuti masa.
Pro postižení stupně tohoto procesu byl vyvinut
čtyřkanálový biosensor:
1) xanthin oxidasa (XOD, EC 1.2.3.2)
2) XOD + nukleosid fosforylasa (NP, EC 2.4.2.1)
3) jako 2 + 5´-nukleotidasa (NT, EC 3.1.3.5)
4) jako 3 + AMP deaminasa (AD, EC 3.5.4.6)
Tak lze postupně určit hladiny všech metabolitů v
tkáni, přitom se navíc dopočítá obsah ATP / ADP
(jejich výchozí množství je obvykle víceméně
konstantní a známé). Vypočítá se procentuální podíl
xanthinu a hypoxanthinu k sumě všech metabolitů tzv.
faktor čerstvosti K. Podle jeho velikosti se pak
rybí maso klasifikuje jako velmi čerstvé (K < 10%),
čerstvé (K < 40%) a kazící se (K > 40%)
Penicilin
stanovován v průběhu fermentační výroby. Pro stanovení jsou
vhodné dva enzymy, β-laktamasa (penicilinasa, EC 3.5.2.6) a
penicilinamidasa (EC 3.5.1.11); oba se spojují s pH sensory
N
S
O
RCONH CH3
CH3
COOH
N
N
SRCO CH3
CH3
COOH
O
N
S
O
NH2 CH3
CH3
COOH
+ R-COOH
Penicilinamidáza
Laktamáza
peniciloinová kyselina
6-APS
Typ penicilinu
(R=):
G ... C6H5CH2Stanovení
penicilinu
12
MMěřěřeneníí enzymových aktivitenzymových aktivit
produkt reakce měřeného enzymu slouží jako substrát indikačního enzymu
imobilizovaného v biokatalytické vrstvě
oproti klasickým fotometrickým postupům u biosensorů často nevadí zákal
nebo zbarvení analyzovaného vzorku.
Laktát dehydrogenasa se měří v klinické praxi (normálně v séru 63 až 155
IU/l u mužů, 62 až 131 IU/l u žen), nárůstá při hepatitidě nebo infarktu.
Substrátem je laktát, sleduje se produkce pyruvátu pomocí sensoru s
pyruvát oxidázou.
α-Amylasa se měří v séru (normálně 60 až 150 U/l), narůstá při akutní
pankreatitidě. Stanovení je možné buď použitím maltopentaózy jako
substrátu a biosensoru s glukóza oxidá-zou, nebo může být substrátem
škrob a pro detekci navíc slouží také glukoamyláza.
Transaminasy indikují funkci jater a objevují se i při infarkt. ALT (normálně
v séru 5 až 24 U/l), AST (5 až 20 U/l), při patologických stavech (hepatitida,
alkoholismus) je možné pozorovat nárůst až 100 až 1000x. Pro ALT jsou
substráty alanin a a oxoglutarát, detekuje se vznikající pyruvát nebo
glutamát. Pro AST jsou substráty aspartát a a oxalacetát a měří se vzniklý
glutamát.
Arginasa je snadno stanovitelná pomocí močovinového biosensoru (ureáza
/ amoni-ak), substrátem je arginin.
MMěřěřeneníí enzymových aktivitenzymových aktivit
aktivity stanovitelné pomocí glukózového biosensoru (glukóza
oxidáza / peroxid vodíku) zahrnují například následující
enzymy (v závorce je uveden potřebný substrát):
alkalická / kyselá fosfatáza, β-glukosidáza (glukóza-6-fosfát),
glukoamyláza (maltóza), invertáza (sacharóza), trehaláza (α,
α'-trehalóza).
aktivity stanovitelné pomocí fenolového biosensoru (tyrosináza
/ kyslík) zahrnují:
alkalická / kyselá fosfatáza (fenylfosfát), β-galaktosidáza
(fenyl- β-D-galaktosid), β-glukosidáza (fenyl-β-D-glukosid),
β-glukuronidáza (fenyl-β-D-glukuronid).
13
MMěřěřeneníí inhibice enzyminhibice enzymůů
pro bioanalytické aplikace je možné využít reakce enzymů
s inhibitory - ty snižují aktivitu imobilizovaného indikačního
enzymu
měření inhibitorů je obvykle velmi citlivé, jedna molekula
analytu zablokuje jednu molekulu enzymu, který následně
přestane konvertovat mnoho molekul substrátu
určitá forma zesilovacího mechanismu
klasifikace inhibicí:
ireverzibilní (nevratné)
reverzibilní kompetitivní (parciální / plná)
nekompetitivní
akompetitivní
směsné
UrUrččeneníí typu inhibicetypu inhibice
kalibrační křivky pro substrát, vždy při určité konstantní
koncentraci inhibitoru
výnos v dvojnásobných logaritmických koordinátách - typické
vzájemné polohy závislostí
log [subs]
log
Signál
r = 1 + [inh]/Kibez inhibitoru
r =
1 2 3
1
2
5
1
3
7
kompetitivní akompetitivní nekompetitivní
14
MMěřěřeneníí inhibice enzyminhibice enzymůů
Inkubační postup
1. výchozí signál
2. inkubace se vzorkem
3. promytí sensoru
4. zbytkový signál
Kontinuální měření
1. odezva na substrát,
2. ustavení ustáleného stavu
3. přídavek vzorku
4. měření poklesu signálu
inkubace se
vzorkem
S
S
S
∆I
dI/dt
Iss
vzorek
Inhibice alkalickInhibice alkalickéé fosfatasyfosfatasy
theophyllin účinkuje jako stimulátor centrální
nervové soustavy, používá se v klinické praxi
jako bronchodilatátor k respirační stimulaci
terapeutickou hladinu v krvi (10 až 20 mg/l) je
třeba sledovat, aby se zabránilo předávkování
inhibice je při použití p-aminofenylfosfátu (PAPP) akompetitivní
jako pufr lze použít tris nebo diethanolamin, mez detekce kolem 5 µM
anorganický fosfát Pi je stanovován mimo jiné v životním prostředí znečištění
vodních toků (podporuje nadměrný růst řas a sinic)
stanovení se provádí s glukosa-6-fosfátem jako substrátem, jeho
hydrolýza ALP je inhibována volným fosfátem kompetitivně
vnikající glukosa se může stanovit pomocí glukosa oxidasy
imobilizované ve stejné vrstvě jako ALP; mez detekce je kolem 10 µM
N
N N
N
H
CH3
CH3
O
O
NH2 O Pi NH2 OH ONH
ALP
theophyllin
-2e-
-2H+
+100 mV
+H2O -Pi
15
Inhibice cholinesterasyInhibice cholinesterasy
enzym účinkuje v nervové soustavě při přenosu vzruchů
organofosfáty
pesticidy (insekticidy dichlorvos, actelic, …)
bojové otravné látky (sarin, soman, tabun, VX)
R alkyl, aryl; R’ alkyloxy, aryloxy, subst. amin;
X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl, fosfodiester;
Z = O nebo S
karbamáty
pesticidy (carbofuran, carbaryl, aldicarb, …)
R,R’ H, alkyl, aryl; X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl
používané enzymy: acetylcholinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) a
butyrylcholinesterasa (BChE, EC 3.1.1.8);
AChE se získává nejčastěji z elektrického úhoře nebo z membrán
erythrocytů, BChE zejména z koňského séra
rekombinantní ChE - lepší inhibiční vlastnosti úpravou aktivního místa
P X
RO
R'
Z
O
C XN
R
R'
Kinetika iKinetika inhibicenhibice ChEChE
volný enzym EH tvoří komplex s inhibitorem PX který rozpadem
poskytuje fosforylovaný enzym EP (fosforyluje resp. karbamoyluje se
hydroxyl serinového zbytku v aktivním místě cholinesterasy)
oxofosforové sloučeniny jsou obecně mnohem silnější než analogické
thiofosfáty, z těch vznikají oxidací (bromová voda, peroxid vodíku)
první krok charakterizuje rovnovážná konstanta KD = k1/k-1, druhý pak
rychlostní konstanta k2; v praxi se však nejčastěji používá bimolekulární
inhibiční konstanta ki = k2/KD
Při inkubačním způsobu měření platí pro signál Y biosensorů:
∆lnY = ki[PX]t, odezva je tedy určována jednak koncentrací a jednak
inhibičními účinky dané látky
pokud není známý druh pesticidu před vlastní analysou, lze stanovit
parametr anticholinesterasová toxicita
EH + PX EH...PX EP
k1
k-1
k2
-HX
16
Variabilita ChE biosensorVariabilita ChE biosensorůů
acetylcholin + H2O kyselina octová + cholin
cholin + 2H2O + O2 betain + 2H2O2 ....... amperom.
kys. octová + H2O octan + H3O+
....... pH sensory
acetylthiocholin + H2O kys. octová + thiocholin ...amper.
indolylacetát + H2O kys. octová + indol ......fluoresc.
(naftylacetát) (naftol)
ChE
ChE
ChE
ChOD
Možnosti měření s cholineseterázovými sensory
PPřřííklad odezvyklad odezvy
i = 0
50 nA
1 min
10 min
vzorek
brambor
(šťáva)
10 min
vzorek
brambor
(šťáva)
+
120 ppb120 ppb
propoxurpropoxur
S
∆Y
inhibice ChE biosensoru = rychlá charakterizace vzorků zelenin a ovoce na
místě odběru, rozsáhlý předběžný screening
podezřelé vzorky znovu analyzovány v laboratořích (GC, HPLC, MS, …).
17
BioNA Biochemical
Nerve Agent Detector
kontrolní jednotka
měřící blok
osobní detektor nervově paralytických látek ve vzduchu
detekované látky: typ “G” and “V”, limit detekce ve vzduchu: 1 ng/L
rychlost odezvy: 30 s (15 s pro 10 ng/L)
hmotnost: 500 g rozměry: 120 x 80 x 35 mm
signalizace alarmu: vizuálně / akusticky
DalDalšíší inhibiceinhibice
tyrosinasa je použitelná pro celé spektrum různých inhibitorů: kyselina
benzoová byla dříve používána jako konservační činidlo, kyselina
salicylová vzniká odbouráváním kyseliny acetylsalicylové (aspirin); celá
řada substituovaných thiomočovin vzniká z glukosinolátů, způsobují
nepříjemné chuťové vlastnosti pokrutin z produkce řepkového oleje
ureasa je velmi citlivá na inhibici, kterou působí různé těžké kovy,
konstrukčně může jít o potenciometrické enzymové elektrody
fotosystém z thylakoidů chloroplastů špenátu nebo fotosyntetických
mikroorganismů (Rhodobacter) se využívá k detekci řady látek
používaných jako herbicidy v zemědělstvi: triaziny, karbamáty,
fenylmočoviny, nitrofenol aj.
difenylkarbazid
(donor e-
)
PQH2
PQ PS II
hν osvětlení
DCIP
(umělý akceptor)
excitace
Princip stanovení inhibitorů fotosystému
18
BiochemickBiochemickéé zesilovaczesilovacíí systsystéémymy
u obvyklých reakcí poskytuje jedna molekula analytu jednu „jednotku“
měřeného signálu; cílem zesílení (amplifikace) je získat z 1 jednotky
analytu (např. 1 molekula) G jednotek signálu (např. G elektronů) a
dosáhnout tak podstatného zvýšení citlivosti stanovení
parametr G pak vystupuje jako zesilovací (amplifikační) faktor
A B
E1
Substrát Produkt
D C
E2
molekula analytu nastartuje jednu nebo i několik
cyklicky probíhajících reakcí, přitom neustále
přechází mezi dvěma formami (Substrát,
Produkt), které jsou přeměňovány dvěma
komplementárními enzymy E1 a E2
(nejjednodušší možnost je kombinace substrát
oxidasa a substrát dehydrogenasa)
reakčního cyklu se dále účastní pomocné látky A
a C a vystupují z něj látky B a D; v nepřítomnosti
A nebo C recyklace neprobíhá, jejich přídavek
tedy vlastně recyklaci „zapíná“
amplifikační faktor G lze určit pomocí závislosti
na parametrech enzymů Ki=Vmax,i/KM,i, tloušťce
biovrstvy L a difúzním koeficientu recyklované
látky uvnitř vrstvy D
G
K K
K K
L
D
≈
+
1 2
1 2
2
klasickým použitím zesilovacího systému
v biosensorech je vysoce citlivé stanovení
laktátu laktát oxidasou a laktát
dehydrogenasou imobilizovanými v jediné
biokatalytické vrstvě
pro systém LOD / LDH bylo dosaženo G
převyšující 4000, mez detekce pro laktát
(nebo pyruvát) činila 1 nM
laktátový systém může být využit také pro
citlivou detekci enzymů produkujících
pyruvát, např. alanin aminotransferázy
O2 H2O2
LOD
laktát pyruvát
LDH
NAD+
NADH
19
VVíícencenáásobnsobnáá
recyklacerecyklace
několikanásobný recyklační systém pro citlivou detekci ATP / ADP byl sestaven
z enzymů HK hexokinasa, PK pyruvát kinasa, LOD, LDH a Cat, katalasa
cykly byly propojeny pomocí pyruvátu, postupným "zapínáním" jednotlivých
cyklů byly zlepšovány parametry stanovení
glukosa-6-P glukosa
HK Cat
ADP ATP H2O2 O2
PK LOD
PEP pyruvát laktát
LDH
NADH NAD+
Enzym G cmin
HK 1 60 µM
+PEP PK 30 2 µM
+NADH LOD/LDH 1700 10 nM
DalDalšíší recyklacerecyklace zajímavý jednoenzymový recyklační systém
využívající různé aktivity jediného enzymu
(laktát dehydrogenasa) pro obě větve cyklu
další kombinace jsou např.: glutamát oxidasa
/ dehydrogenasa (glutamát ev. amoniak);
alkohol oxidasa / dehydrogenasa (alkohol);
glutamát oxidasa / alanin aminotransferasa
(a-oxoglutarát, glutamát); lakasa / cyto-chrom
b2 (benzochinon); laktát monooxygenasa /
malát dehydrogenasa (malát, oxaloacetát,
AST)
chemická recyklace byla na poli biosensorů
použita ke zcitlivění detekce kyseliny
askorbové pomocí kyslíkové elektrody s
askorbát oxidasou, zpětná redukce kyseliny
dehydroaskorbové probíhala v přítomnosti
cysteinu
jako příklad elektrochemické recyklace lze
uvést tyrosi-názový biosensor. Postup se
používá pro stanovení feno-lu, který po
oxidaci tyrosinasou poskytne recyklující pyrokatechol.
Obdobné schema je využitelné
pro lakázu a recyklující pár hydrochinon /
benzochinon
glyoxylát oxalát
LDH
NAD+
NADH
LDH
laktát pyruvát
O2
tyrosinasa
pyrokatechol o-chinon
l
2e-300
mV
20
Recyklace fosfRecyklace fosfáátutu
maltosa α -D-glukosa
maltosa fosforylasa
Pi glukosa-1-fosfát
fosfatasa
mutarotasa
β-D-glukosa
glukosa oxidasa
O2
glukonolakton + H2O2
Eliminace interferencEliminace interferencíí
při analýze reálných vzorků se přítomné interferující složky konvertují
(váží) vedle vlastního analytu a ruší stanovení na různých funkčních
stupních biosensoru
eliminací by se veškeré interferující látky měly odstranit nebo převést na
nerušící produkty - tohoto efektu se dosáhne předřazením eliminačního
systému vlastnímu biosensoru
převodník
biorekogniční
vrstva
antiinterferenční
vrstva
analyt rušivé
látky
21
kyselina askorbová může rušit v séru, pokud je konečnou fází amperometrická
oxidace peroxidu vodíku, může být eliminována předřazením biomembrány
s askorbát oxidasou (neprodukuje peroxid vodíku)
jinou možností je použití ferrikyanidu ve spojení s lakasou (bez lakasy by vadil
vzniklý ferrokyanid)
další možností je předřadit vhodnou antiinterferenční vrstvu přímo vlastnímu
převodníku - pro askorbát přichází do úvahy použít negativně nabitou
membránu, např. velmi hustou acetylcelulosu
lze provést elektrooxidaci askorbátu před příchodem do biokatalytické vrstvy:
PPřřííkladyklady
amoniak je často detekovaným produktem enzymových reakcí, ale současně
může být přítomen volný ve vzorku (sérum, moč), lze ho odstranit pomocí
glutamát dehydrogenasy:
Lakasa
2[Fe(CN)]6
4+
1/2O2 + 2H+
2[Fe(CN)]6
3+
H2O
askorbát + 2[Fe(CN)]6
3dehydroaskorbát
+ 2[Fe(CN)]6
4NH3
+ H
+
+ NADH + α-glutarát L-glutamát + NAD
+
GDH
glukosa ve volném stavu bude vadit u řady víceenzymových systémů
pro stanovení složitějších cukrů
pro její odstranění lze použít antiinterferenční vrstvu obsahující glukosa
oxidasu a katalasu (rozkládá vznikající peroxid vodíku), tento postup
funguje do asi 2 mM koncentrace
pokud nemá být ovlivněna hladina kyslíku v okolí biosensoru, je možné
spotřebovat glukosu fosforylací ATP pomocí hexokinasy:
kyslík je možné z okolí biosensoru odstranit jeho spotřebou při oxidaci
glukosy glukosa oxidasou.
Hexokinasa
glukosa + ATP glukosa-6-fosfát + ADP
22
BioanalytickBioanalytickáá stanovenstanoveníí v organickv organickéé ffáázizi
Výhody bioreakcí v organické fázi:
zvýšená rozpustnost nepolárních substrátů (analýzy tuků či olejů)
změněné reakční rovnováhy (místo hydrolýzy často probíhá syntéza)
zvýšená termální stabilita (fixovaná struktura biomakromolekul)
zjednodušená imobilizace prostou adsorpcí
neprobíhají rušivé reakce s účastí vody
nenastává bakteriální kontaminace
organická fáze
reverzní micela
interfáze
E E
pro činnost enzymů v organické fázi je
potřeba jisté minimální množství vody (1 až
5 %) - hydratační obal bílkoviny
obvykle nelze používat rozpouštědla volně
mísitelná s vodou, která hydratační obal
kompletně odstraní
nepolární rozpouštědla je vhodné nasytit
předem vodou
na povrchu bílkoviny existuje přechodová
oblast - interfáze, někdy je pro její tvorbu
vhodné přidat hexanol nebo detergent
CTAB, cetyl trimethylamonium bromid).
Polarita rozpouPolarita rozpouššttěědeldel
Pro posouzení polarity rozpouštědel se používá
partiční koeficient P, což je vlastně rozdělovací
poměr daného rozpouštědla mezi oktanol a vodu:
P = [rozp]oktanol/[rozp]voda
nižší hodnota znamená méně polární rozpouštědlo
Podle velikosti log P lze přibližně vymezit tři skupiny
rozpouštědel:
log P < 2 nejsou vhodná, narušují vodný obal
biomokuly; někdy jsou použitelná
ve směsi s vodou
2 < log P < 4 účinek rozpouštědla na aktivitu
enzymu je třebavyzkoušet
log P > 4 obecně jsou použitelná, vodný obal
enzymunení narušen
8.8hexadekan
5.6dekan
3.4hexan
3.0pentan
2.5toluen
2.0benzen
2.0chloroform
1.5cyklohexanol
0.85ether
0.80butanol
0.49tetrahydrofuran
-0.23aceton
-0.24ethanol
-0.76methanol
-1.0dimethylformamid
-1.1dioxan
-1.3dimethylsulfoxid
log P
23
Aktivita v organickAktivita v organickéé ffáázizi
průběh aktivity enzymu v závislosti na polaritě rozpouštědla má
charakteristický esovitý tvar
imobilizovaný enzym obvykle lépe snáší i méně polární rozpouštědla;
mimo polaritu rozpouštědla je samozřejmě nutné zvážit také jeho
dostupnost, těkavost, cenu a případně toxicitu
někdy je výhodné použít místo čistého rozpouštědla mikroemulze
tvořené směsí rozpouštědla (1 až 10 %), vody a vhodného detergentu
(0.05 až 0.5 %).
-2 0 2 4
log P
100
aktivita
0
imobilizovaný enzym volný
PPřřííklady stanovenklady stanoveníí
aplikace se zaměřují na ve vodě nerozpustné analyty nebo vzorky
nejvíce biosensorů je založeno na použití tyrosinasy - je vhodná pro
stanovení fenolů v oleji nebo v organických extraktech z vody, na
základě inhibice jde stanovit substituované thiomočoviny (vznikají z
glukosinolátů, které znehodnocují krmné směsi s řepkou).
podobně lakasa je vhodná pro p-difenoly
peroxidáza mimo detekce peroxidu vodíku slouží také pro detekci
organických hydroperoxidů, které vznikají v tucích při jejich rozkladu
cholesterol v másle a margarínech lze v organické fázi výhodně stanovit
cholesterol oxidasou
acetylcholinesterasy slouží pro detekci pesticidů (organofosfáty,
karbamáty) po extrakci z vodné fáze
v poslední době se objevují i pokusy provádět v organické fázi některá
imunochemická stanovení nízkomolekulárních toxických látek
24
Modely biokatalytických sensorModely biokatalytických sensorůů
pro popis a optimalizaci dílčích procesů tvořících odezvu
biosensoru (látkový transport, enzymová reakce, elektrodová reakce)
amperometrické biosensory jsou nejčastějším objektem modelování,
uplatňuje se zde několik východisek:
enzymová reakce (1, 2, více) převádí analyt stechiometricky na snadno
měřitelnou látku; uvažuje se lineární reakce (reakční rychlost je přímo
úměrná koncentraci), nelineární reakce vedou k numerickému řešení
modelování lze provádět buď stacionárně pro předpokládaný ustálený
stav (očekává se nezávislost nalezeného řešení na čase)
nebo dynamicky, kdy model obsahuje časovou proměnnou, takže lze
nalézt řešení v žádaném časovém okamžiku
pro nalezení řešení je velmi důležitý popis situace v přechodových
oblastech, což jsou rozhraní povrch elektrody / biokatalytická vrstva /
okolní roztok
Modelovaný systModelovaný systéémm existuje jistý počet navazujících vrstev, což
je nejčastěji soubor několika membrán
(enzymová, dialysační pro kontrolu
transportu, mechanická ochrana, …) na
povrchu elektrody
předpoklady:
dobře míchaný okolní roztok
zanedbatelná spotřeba okolního analytu v
důsledku činnosti biosensoru
zachování hmoty při přechodu mezi
vrstvami
nulový tok neaktivních částic na povrchu
elektrody,
elektroaktivní látka je na povrchu elektrody
úplně spotřebována (c=0)
enzymová
vrstva
elektroda
okolní
roztok
d 0
x-ová osa
symbolika:
S, P, A, B (…) značí koncentrace substrátu, produktu a dalších pomocných látek,
v okolním roztoku jsou koncentrace So, Po, Ao atd.
rozměr (vzdálenost) je x, počátek = rozhraní enzymové vrstvy a okolního roztoku.
čas je t, modelování začíná v čase 0
pro jednotlivé látky jsou difúzní koeficienty DS, DP, atd
rychlostní konstanta enzymové reakce je k (lineární reakce, k = Vmax/KM)
koncentrace v daném místě a čase jsou S(x,t), derivace podle času jsou St(x,t),
podle x pak Sx(x,t) a Sxx(x,t)
25
PPřřííkladklad řřeeššeneníí nejjednodušší amperometrický
biosensor (1 vrstva, 1 enzym, lineární
reakce) je uvedeno pro ilustraci.
Předpokládejme konverzi substrátu
(analytu) enzymem a následnou
elektrochemickou detekci produktu (Ai
značí pomocné látky):
Enzym
S + A1 P + A2
k
P + e-
A3
elektroda
Rovnice a podmínky pro stacionární řešení substrátu a produktu:
0 = DSSxx – kS 0 = DPPxx + kS
S(0) = So Sx(d) = 0 P(0) = 0 P(d) = 0
Vyřešení diferenciálních rovnic pak poskytuje rovnice pro koncentrace
obou látek uvnitř biovrstvy po ustavení ustáleného stavu:
P
So
S
o
D
D
Qd
xdQ
Qdd
x
SxP
D
k
Qkde
Qd
xdQ
SxS
⎭
⎬
⎫
⎩
⎨
⎧ −
++⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
−=
=
−
=
)cosh(
)](cosh[
11
)cosh(
1
)(
)cosh(
)](cosh[
)(
proud v ustáleném vztahu ISS je vlastně dán tokem produktu P na
povrchu elektrody Px(d):
ISS = nFADPPx(d)
n značí počet elektronů, F je Faradayova konstanta, A plocha elektrody.
výsledky teroretického modelu je možné porovnat s experimentálně
stanoveným proudem biosensoru
pro tento jednoduchý příklad existuje řešení i pro dynamický model:
St = DSSxx – kS
S(0,t) = So Sx(d,t) = 0 S(x,0) = 0
Pt = DPPxx + kS
P(0,t) = 0 P(d,t) = 0 P(x,0) = 0
časový průběhu koncentrace substrátu:
časový průběh proudu ISS je úměrný toku produktu na povrchu
elektrody Px(d,t) :
I(t) = nFADPPx(d,t)
2
22
0 4
)12(])(exp[
2
12
cos
12
)1(4
1),(
d
n
Du
ku
tkuuk
d
xdn
n
StxS S
n
n
o π
π
π
+
=
⎭
⎬
⎫
⎩
⎨
⎧
⎥⎦
⎤
⎢⎣
⎡
+
+−+
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛ −+
+
−
−= ∑
∞
=
26
GrafickGrafickéé znznáázornzorněěnníí
na základě dynamického řešení je možné zkonstruovat koncentrační
profily substrátu a produktu uvnitř biovrstvy na povrchu elektrody
na obrázku jsou použity pro názornost bezrozměrné souřadnice
vyvinutý model umožňuje studovat vliv změny parametrů (tloušťka
biovrstvy, aktivita enzymu, průchodnost vrstvy) na odezvu biosensoru
0 x/d 1
1
S/So
0
0 x/d 1
0.25
P/So
0
Koncentrační profily v enzymové vrstvě
MeznMezníí ppřříípadypady řřeeššeneníí
rovnici pro signál v ustáleném stavu lze dále zjednodušit:
zavádí se Thieleho modul Φ, pak lze
podle velikosti tohoto modulu určit dvě
limitní oblasti činnosti biosensoru, pro
něž se dají odvodit rovnice pro ISS
pro velmi malé Φ (Φ → 0) je odezva biosensoru určována pouze
rychlostí enzymové reakce, existuje kinetická kontrola
pro přibližné řešení se cosh Φ nahradí aritmetickou řadou (Taylorův
rozvoj, ze které se použije pouze první člen, cosh Φ = 1 + Φ 2 + … :
ISS ≈ nFASokd/2
naopak pro velmi velká Φ (Φ -> ∞) převládne vliv transportních procesů
uvnitř biovrstvy, nastává difúzní kontrola
pro zjednodušení se použije:
což konečně vede ke zjednodušenému výrazu:
ISS ≈ nFADSSo/d
oba výrazy platí poměrně dobře pro reálné odezvy biosensorů
SMS DK
V
d
D
kd
Qd max
2
===Φ
0
cosh
1
lim
0
=
Φ→Φ
27
Limitace odezvy enzymovLimitace odezvy enzymovéého sensoruho sensoru
Pokud je analyt současně substrátem pro enzym imobilizovaný v
biosensoru, je výhodné pracovat za podmínek difúzní kontroly: na
odezvu nemá výrazný vliv rychlost enzymové reakce, takže případný
postupný úbytek enzymové aktivity v biovrstvě enzymu se na velikosti
signálu nemusí prakticky vůbec projevit.
Biosensor obvykle vykazuje konstantní citlivost, která pak náhle klesne
(enzymová aktivita se vyčerpá). Difúzní kontrola nastává u biovrstev s
vysokou koncentrací enzymu, jinak ji lze dosáhnout předřazením málo
propustné difúzní bariéry (kontrolní membrána).
Kinetická kontrola - druhý limitní typ – je výhodný zase pokud analyt
funguje jako inhibitor imobilizovaného enzymu. Pak se i malé poklesy
aktivity v důsledku inhibice ihned projeví poklesem signálu biosensoru.