1
BuBuňňky a biosensoryky a biosensory
bubuňňky jako biorekogniky jako biorekogniččnníí elementelement
studium vlastnoststudium vlastnostíí bunbuněěk pomock pomocíí
biosensorových technologibiosensorových technologiíí
BunBuněčěčný systný systéémm
bubuňňky jsou schopnky jsou schopnéé velmi citlivvelmi citlivěě reagovat na rreagovat na růůznznéé
podnpodněěty z okolty z okolíí, zejm, zejmééna na pna na přříítomnost rtomnost růůznýchzných
chemikchemikááliliíí
biologický a biomedicbiologický a biomedicíínský výzkumnský výzkum
farmaceutický vývoj nových lfarmaceutický vývoj nových lééččiviv
detekce nových nebo nezndetekce nových nebo neznáámých toxických lmých toxických láátek vtek v
podezpodezřřelých vzorcelých vzorcííchch –– pokud nempokud nemááme k dispozicime k dispozici
(nebo nezn(nebo neznááme) konvenme) konvenččnníí biorekognibiorekogniččnníí molekulymolekuly
(enzym, protil(enzym, protiláátka, DNA,tka, DNA, ……))
hlavnhlavníí motivace = jaký jemotivace = jaký je úúččinek testovaninek testovanéé lláátkytky
nana žživý organismusivý organismus
2
Výhody bunVýhody buněčěčných sensorných sensorůů
biochemickbiochemickáá slosložžka v aktivnka v aktivníímm žživotnivotníím stavum stavu -- jednjednáá sese
o mikrobio mikrobiáálnlníí, rostlinn, rostlinnéé nebonebo žživoivoččiiššnnéé bubuňňky neboky nebo
jejich subceluljejich subceluláárnrníí elementy (organely) nebo celelementy (organely) nebo celéé tktkáánněě
čči orgi orgáányny
biokomponenta je v pbiokomponenta je v přřirozenirozenéém prostm prostřřededíí -- ppřřííznivznivéé propro
jejjejíí aktivitu a stabilituaktivitu a stabilitu
mmíísto jedinsto jedinéého enzymu lze pouho enzymu lze použžíít celt celéé metabolickmetabolickéé
reakreakččnníí sekvence, optimalizovansekvence, optimalizovanéé ppřřirozenou cestouirozenou cestou
nejsou nutnnejsou nutnéé izolaizolaččnníí a purifikaa purifikaččnníí kroky (nkroky (níízkzkáá cema)cema)
pokud jsou zachovpokud jsou zachováányny žživotnivotníí podmpodmíínkynky -- spontspontáánnnníí
obnova vyuobnova využžíívanvanéé enzymovenzymovéé aktivityaktivity
MikrobiMikrobiáálnlníí sensorysensory
bakterie, sinicebakterie, sinice čči kvasinky, imobilizovani kvasinky, imobilizovanéé bubuďď na povrchuna povrchu
ppřřevodnevodnííku (membrku (membráánový typ) nebo ve formnový typ) nebo ve forměě ppřřededřřazenazenééhoho
reaktorureaktoru
problprobléémm -- existenceexistence řřady enzymových systady enzymových systéémmůů v buv buňňce; zlepce; zlepššeneníí
selektivity:selektivity:
–– indukce = pindukce = přříídavek potencidavek potenciáálnlníího analytu = substrho analytu = substráátu vyvoltu vyvoláá zvýzvýššenouenou
tvorbu komponent metabolicktvorbu komponent metabolickéé drdrááhyhy
–– inhibice = potlainhibice = potlaččíí se funkce nese funkce nežžáádoucdoucíích aktivitch aktivit
imobilizaceimobilizace
–– zachycenzachyceníí bunbuněěk pk přřefiltrovefiltrováánníím pm přřes vhodnou membres vhodnou membráánu ve formnu ve forměě
„„pastypasty““ nebo filmu uvnitnebo filmu uvnitřř ppóórrůů membrmembráány (filtrany (filtraččnníí pappapíír, polyamid,r, polyamid,
celulosa). Dynamickcelulosa). Dynamickéé vlastnosti výslednvlastnosti výslednéého sensoru budou zho sensoru budou zááviset naviset na
tloutlouššťťce a porozitce a porozitěě membrmembráány a vlastnostech bunny a vlastnostech buněčěčnnéé ststěěny mikroba.ny mikroba.
–– stabilnstabilněějjšíší je zachycenje zachyceníí bunbuněěk uvnitk uvnitřř gelu pgelu přři jeho tvorbi jeho tvorběě. Nelze pou. Nelze použžíítt
ppřříílilišš drastickdrastickéé podmpodmíínkynky -- agar, kolagen,agar, kolagen, žželatinu, polyakrylamid neboelatinu, polyakrylamid nebo
polyvinylalkohol.polyvinylalkohol.
–– kovalentnkovalentníí vazba bunvazba buněěk nevhodnk nevhodnáá -- dojde ke znidojde ke zniččeneníí bunbuněčěčnnéé ststěěny.ny.
mikrobimikrobiáálnlníí slosložžku je nejku je nejččastastěěji moji možžnnéé spojit s kyslspojit s kyslííkovoukovou
elektrodou, delektrodou, dáále pak se sensory pro COle pak se sensory pro CO22 nebo amoniak, je monebo amoniak, je možžnnéé
poupoužžititíí medimediáátortorůů ppřřenosu elektronenosu elektronůů (ferrikyanid)(ferrikyanid)
peroxid vodperoxid vodííku obvykle nenku obvykle neníí produkovprodukováán (toxický pro bun (toxický pro buňňky)ky)
3
MikrobiMikrobiáálnlníí sensorysensory
historickyhistoricky -- mměřěřeneníí metabolitmetabolitůů (glukosa a dal(glukosa a dalšíší
sacharidy, laktsacharidy, laktáát)t) -- dnes jidnes jižž ppřřekonekonáánono
specispeciáálnlníí kmenykmeny PseudomonasPseudomonas -- exotickexotickéé aktivity,aktivity,
momožžnost detekovat aromaticknost detekovat aromatickéé uhlovoduhlovodííky (benzen) iky (benzen) i
vyslovenvysloveněě toxicktoxickéé lláátkytky -- fenol (dezinfekfenol (dezinfekččnníí prostprostřředek)edek)
stanovenstanoveníí BSK (BOD, biochemical oxygen demand)BSK (BOD, biochemical oxygen demand) --
mmííra znera zneččiiššttěěnníí (odpadn(odpadníích) vod organickými polutantych) vod organickými polutanty
–– klasickklasickéé mměřěřeneníí trvtrváá 5 dn5 dnůů (BSK(BSK55))
–– biosensorbiosensor -- OO22 sensor s imobilizovaným mikrobemsensor s imobilizovaným mikrobem
((Trichosporon cutaneumTrichosporon cutaneum,, Bacillus subtilisBacillus subtilis aa licheniformislicheniformis
–– mměřěříí se rychlost respirace po pse rychlost respirace po přříídavku vzorku, potdavku vzorku, potřřebnebnáá doba jedoba je
ppřřitom pouze nitom pouze něěkolik minutkolik minut
–– kalibrakalibraččnníími substrmi substrááty jsou obvykle smty jsou obvykle směěs glukosy a kyselinys glukosy a kyseliny
glutamovglutamovéé
TkTkááňňovovéé řřezyezy
tenkýtenký řřez vhodnez vhodnéé ččáásti rostliny se uchytsti rostliny se uchytíí pomocpomocíí ssííťťkyky
ppřřed vlastned vlastníí sensorsensor
Rostlina (použitá část) Enzym Analyt
žampion (plodnice) tyrosináza fenoly
brambor (hlíza) tyrosináza fenoly
banán (dužina) (banantroda) tyrosináza dopamin
okurek, tykev (řez plodu, šťáva) askorbát oxidáza vitamin C
okurek cystein
křen peroxidáza peroxid vodíku
sója ureáza močovina
chryzantémy (okvětní lístky) aminokyseliny
4
BunBuněčěčný systný systéémm -- komplexnostkomplexnost
vstupní signály
růstové faktory, antigeny/protilátky, hormony, adhezní faktory, teplota, pH, …
výstupní signály
pH, ionty (Na+, K+, Ca2+, Cl-), regulační látky (NO, glutamát, ...), obranné (ROS peroxid
vodíku, superoxid. radikál), adheze, morfologie, CO2, membr. potenciál, …
receptory
modulátory
metabolismus
pH
pH-
regulace
vesikulární
transport
O, glukosa, léčiva2
adheze
a
morfologie
proliferace
enzymové kaskády
cytostatika
BunBuněčěčný biosensorný biosensor
ppřřibliblíížženeníí se in vivo stavuse in vivo stavu
(sterilita, zaji(sterilita, zajiššttěěnníí ppřříísunusunu
žživin, biokompatibilita,ivin, biokompatibilita, ……))
chemické/
fyzikální
sensory
signály
sběr
údajůvstupy
cell(s)
Testovaný
vzorek
výstupy
fyziologické
vstupy
(O2,glukosa,
růstové faktory,
T, pH, ..)
…
H+,
CO2,
adh.,
metabol.,
..
…
neinvazivnneinvazivníí, on, on--line zline zááznamznam
multiparametrický charaktermultiparametrický charakter
ččíím vm vííce parametrce parametrůů se podase podařříí sledovatsledovat
paralelnparalelněě a soua souččasnasněě, t, tíím lm léépe se porozumpe se porozumíí
slosložžitým bunitým buněčěčným odezvným odezváámm
5
MMěřěřííccíí systsystéémm
acidifikaceacidifikace –– pH ISFETpH ISFET
kyslkyslííkk –– ClarkClarkůův sensorv sensor
adhezeadheze –– IDE (impedance)IDE (impedance)
iontyionty –– ISFETyISFETy
teplotateplota –– Pt100Pt100
bioelektrickbioelektrickéé dděějeje ––
mikroelektrodymikroelektrody
CMOS technologieCMOS technologie ––
miniaturizace, standardizace,miniaturizace, standardizace,
kombinace sensorkombinace sensorůů aa
vyhodnocovacvyhodnocovacíí elektroniky naelektroniky na
ttéémmžž ččipuipu –– integrace,integrace,
paralelizaceparalelizace
BionasBionas
6
UkUkáázka zzka zááznamu z bioznamu z bioččipuipu
AcidifikaceAcidifikace
RespiraceRespirace
AdhezeAdheze
vlivvliv
paracetamoluparacetamolu
na kulturuna kulturu
fibroblastfibroblastůů
Triton XTriton X--100100
detergentdetergent
KonfiguraceKonfigurace
kompaktnkompaktníí systsystéém,m,
bubuňňky kultivovky kultivováányny
ppřříímo na povrchumo na povrchu
(elektrochemických)(elektrochemických)
sensorsensorůů, vhodn, vhodnéé
kombinovat i skombinovat i s
fluorescenfluorescenččnníímm
mměřěřeneníímm
bubuňňky separovky separováány odny od
mměřěřííccíích sensorch sensorůů
pomocpomocíí vhodnvhodnéé
membrmembráány (kultivaceny (kultivace
na membrna membráánovýchnových
insertech)insertech)
7
References:
- Vörös, J. et al. “Optical Grating Coupler Biosensors”,
Biomaterials 23 (2002) 3699-3710
- Szekacs, A. et al
- Madarasz, E. et.al
--
Signál
(Impedance,
Resistance,
Resonance, …)
Cell shape:
nástřik,
sedimentace
výchozí
kontakty
rozprostírání,
uvolňování matrix proteinů
pasivní sedimentace
6 – 30 min
10 µm
10 µm
adhezivní
neadhezivní
60
min
latence
Kontakt bunKontakt buněěk s povrchemk s povrchem
NormNormáálnlníí vs. apoptickvs. apoptickéé bubuňňkyky
pohodlnpohodlnéé sledovsledováánníí
morfologických zmmorfologických změěn an a
adheze pomocadheze pomocíí
piezoelektrickýchpiezoelektrických
sensorsensorůů --
viskoelastickviskoelastickéé procesyprocesy
CO2 incubator
syringe
input tube
lever
oscillator A/D converter
counter
computer
RS232C
RS232C
chamber
with sensor
0 2 4 6 8 10
-300
-200
-100
0
WB F344
(vitronectin)
0
20
40
60
t (h)
∆f
(Hz)
∆R
(Ω)
A
8
intracelulární
záznam
extracelulární
záznam
NeuronyNeurony
NeuroNeuroččipip
AkAkččnníí potencipotenciááll
-- 8x CPFET8x CPFET
a 64x microeldaa 64x microelda
pHpH –– 2x ISFET2x ISFET
teplotateplota –– diodadioda
integrovanintegrovanáá
elektronikaelektronika –– filtry,filtry,
zesilovazesilovačče,e,
multiplexer, Imultiplexer, I22
CC
sbsběěrnice, stimularnice, stimulaččnníí
obvodyobvody
9
MMěřěřííccíí systsystéémm
BunBuněčěčnnéé biosensorybiosensory
znaznaččný potenciný potenciáál do budoucna v oblasti výzkumul do budoucna v oblasti výzkumu
((šíšířřeneníí nervových vzruchnervových vzruchůů, um, uměělláá pampaměťěť, rozpozn, rozpoznáávacvacíí
a vyhodnocovaca vyhodnocovacíí funkce,funkce, „„uuččenení“í“, ...), ...)
nnááhrada testhrada testůů toxicity novýchtoxicity nových čči podezi podezřřelých lelých láátektek --
dosud se provdosud se provááddíí pomocpomocíí experimentexperimentáálnlníích zvch zvíířřatat
vyhledvyhledáávváánníí a testova testováánníí nových druhnových druhůů llééččiviv
komplikacekomplikace
–– velmi komplexnvelmi komplexníí systsystéém, nm, nááchylný na pochylný na pošškozenkozeníí, nen, neníí snadnsnadnéé
udrudržžovat v optimovat v optimáálnlníím stavum stavu
–– obtobtíížžnnéé uchovuchováávváánníí a transport (musa transport (musíí se pse přřipravit in situ)ipravit in situ)
–– komplexnkomplexníí odezvy, informace bývodezvy, informace býváá skryta v napohledskryta v napohled
chaotických datechchaotických datech -- úúloha chemometrie a softwareloha chemometrie a software