NÁPRAVA EKOLOGICKÝCH ŠKOD 3. ČÁST Omezující faktory pro biologickou remediaci Mikroorganismy pro bioremediaci VÍT MATĚJŮ ENVISAN-GEM, a.s. Biotechnologická divize, Radiová 7, 102 31 PRAHA 10 envisan@grbox.cz O ČEM TO BUDE ? 1. Faktory ovlivňující biologickou dostupnost polutantů, transport do buňky 2. Podpora přenosu hmoty, biosurfaktanty, biodegradovatelnost polutantů, biodegradace, biotransformace 3. Mikroorganismy pro sanaci – kvasinky, dřevokazné houby, bakterie BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST POLUTANTŮ Biologická rozložitelnost polutantu závisí na: • Struktuře a náboji molekuly • Polaritě • Rozpustnosti ve vodě • Stupni zvětrání • Biologické dostupnosti • Enzymatickém vybavení mikroorganismu • Transportu do buňky (přenosu hmoty) TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • Bakterie nevytvářejí exoenzymy pro rozklad polutantů • Rozklad probíhá v buňce • Molekuly se do buňky dostávají přes buněčnou membránu • Transport do buňky je: - aktivní (přenašeče) - pasivní (např. difúze) TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • PASIVNÍ TRANSPORT – DIFÚZE není třeba energie, je to pohyb molekul z prostředí s vyšší koncentrací do prostředí s nižší koncentrací látky TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • PASIVNÍ TRANSPORT – PODPOROVANÁ DIFÚZE Není třeba ATP, ale musí být přítomna přenosová bílkovina, která zprostředkovává přenos z prostředí s vyšší koncentrací do prostředí s nižší koncentrací TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • PASIVNÍ TRANSPORT – OSMÓZA Pohyb vody (červené tečky) polopropustnou membránou do místa s vyšší koncentrací rozpuštěných látek (modré tečky) TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • AKTIVNÍ TRANSPORT Pro aktivní transport je třeba energie (např. ve formě ATP) TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • AKTIVNÍ TRANSPORT - ENDOCYTOSA Při tomto způsobu transportu vnesená látka neprochází buněčnou membránou TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) • Rychlost přenosu hmoty do buňky je z hlediska rychlosti biodegradace určujícím krokem, protože je nejpomalejší. • U nepolárních sloučenin bakterie podporuje transport tvorbou povrchově aktivních látek (biosurfaktanty), které konjugují s molekulami polutantu a vytvářejí polární konjugovaný komplex, usnadňující přenos do buňky. TRANSPORT DO BUŇKY (PŘENOS HMOTY) Fyzikální nedostupnost polutantu BIODOSTUPNOST POLUTANTU VĚTRÁNÍ (STARNUTÍ) POLUTANTU Na stárnutí polutantů a snižování dostupnosti se podílí: • Sorpce na pevné částice půdy (jíl) • Sorpce na organické látky v půdě (huminové látky) • Difúze do mikropórů a makropórů • Odpar těkavých složek • Úbytek dobře odbouratelných složek znečištění VĚTRÁNÍ (STARNUTÍ) POLUTANTU VĚTRÁNÍ (STARNUTÍ) POLUTANTU 1. v systémech s jedním polutantem: dochází při zvyšování kontaktního času mezi polutantem a půdou ke snižování biologické dostupnosti a odbouratelnosti 2. v systémech s více polutanty přítomnost dalších látek zpomaluje stárnutí a zvyšuje biologickou dostupnost polutantu 3. Sorbované molekuly jsou nejčastěji důvodem „reboundingu“ REBOUNDING REBOUNDING POLARITA MOLEKULY Hydrofóbní molekuly: - silná sorpce na pevné částice horninového prostředí a v organickém podílu - rozpouštějí se v nepolárních látkách přítomných v prostředí (ropné uhlovodíky) - transport do buňky je možný pouze pokud jsou rozpuštěné ve vodě NEZBYTNÁ PODPORA PŘENOSU HMOTY MAKROSKOPICKÉ PARAMETRY MOLEKULY Mezi nejčastěji používané makroskopické parametry k popisu molekul patří: - stupeň hydrofobicity - rozdělovací koeficient polutantu oktanol-voda - doba zdržení při HPLC Zvyšování rozdělovacího koeficientu oktanol-voda v některých případech vede ke snižování rychlosti biodegradace STRUKTURA MOLEKULY • Adice halogenového iontu, nitroso skupiny, CN, sulfátu, halogenu či methylu k jednoduchému aromatickému uhlovodíku, mastné kyselině či jiné molekule podstatně zhoršuje biologickou rozložitelnost • adice hydroxylové, karboxylové či amidické skupiny stimuluje biodegradovatelnost rozložitelnost klesá se stoupající alkylací a halogenací původní látky Chybí enzymy pro rozklad PODPORA PŘENOSU HMOTY Vlastnosti bakterií podporující přenos hmoty: • tvorba biologických povrchově aktivních látek a jejich exkrece do prostředí • vznik struktur na povrchu buňky, které podporují emulgaci hydrofobních molekul polutantu • systém příjmu s vysokou afinitou k polutantu • zvýšená adhese buněk k pevnému nebo kapalnému substrátu BIOFILM BIODEGRADOVATELNOST POLUTANTŮ • Podle biologické rozložitelnosti lze polutanty seřadit podle snižující se biologické rozložitelností: jednoduché alifatické uhlovodíky, paliva > monoaromatické uhlovodíky > alkoholy, estery > nitrobenzeny, ethery > chlorované uhlovodíky > polycyklické aromatické uhlovodíky > pesticidy. n-Alkany: • Nejsnáze molekuly C10 až C16 • C1 až C4 jsou plynné, rozkládají je jen vysoce specializované bakterie • C5 až C9 jsou pro většinu mikroorganismů toxické PODPORA PŘENOSU HMOTY Zpřístupnění molekul polutantů pro buňky: • Přídavkem neionogenní povrchově aktivní látky (NPAL) • Částečná chemická oxidace OZONE PHENANTHRENE ANTHRACENE PYRENE DIESEL PODPORA PŘENOSU HMOTY • Ohřev horninového prostředí (odporové ohřívání, vhánění páry…..) • Uvolnění sorpčních vazeb molekul polutantů ultrazvukem • Podpora tvorby biosurfaktantů PODPORA PŘENOSU HMOTY – TVORBA BIOSURFAKTANTŮ BIOSURFAKTANTY BIOSURFAKTANTY • Všechny bakterie, které jsou schopné využívat nepolární substráty, mají schopnost biosurfaktant vytvářet a uvolňovat do prostředí • Bez biosurfaktantu by nebyly schopné dopravit substrát do buňky Molekula polutantu polární Molekula polutantu nepolární Micela neionogenní povrchově aktivní látky BIOSURFAKTANTY OMEZUJÍCÍ FAKTORY PRO BIODEGRADACI • Přenos hmoty do buňky • Dostupnost molekul polutantu pro mikroorganismy (sorpce, rozpustnost) • Enzymatický aparát mikroorganismů • Tvorba toxických metabolitů • Inhibiční podmínky v prostředí (toxicita polutantů, pH, teplota, nedostatek vlhkosti, nedostatek finálních akceptorů elektronů, limitace makro a mikrobiotickými prvky …..) • Neschopnost odbourávat některé polutanty vedle sebe (např. toluen a chlorbenzen) PODPORA VYMYTÍM Vymytí povrchově aktivní látkou ROZDĚLENÍ ZBYTKOVÉHO ZNEČIŠTĚNÍ Nenasycená zóna Saturovaná zóna SOUHRN OMEZUJÍCÍCH FAKTORŮ Galaktosa a glukosa pro E. coli DEAD-END PRODUKTY PYRENU - HOUBY ODBOURÁVÁNÍ POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ HOUBY Cytochrom P-450 peroxidasa BAKTERIE Diooxygenasa DŮSLEDKY TVORBY DEAD-END PRODUKTŮ 1. PROBLÉM • Stanovení PAU po extrakci nepolárními rozpouštědly • Biotransformační produkty jsou polární – nestanoví se, nastává pokles koncentrace PAU - HURÁÁÁÁ !!! • Skutečnost Biotransformační produkty a dead-end produkty jsou ve vodě mnohem rozpustnější a tedy mobilnější, jsou však často i toxičtější než původní PAU, takže zemina se sníženou koncentrací PAU po biodegradaci je z hlediska životního prostředí mnohem škodlivější, má podstatně vyšší ekotoxicitu a genotoxicitu DŮSLEDKY TVORBY DEAD-END PRODUKTŮ 2. PROBLÉM • Heterocyklické sloučeniny podléhají rovněž biotransformaci – vznikají toxičtější produkty • Pentachlorfenol tvoří v technické směsi jen 30 až 35 %, jsou tedy přítomny další kongenery – ale ty se nesledují (analyticky) • Vedlejší produkt z chlorace fenolu – polychlorované dioxiny!!!! BIOTRANSFORMACE MÍSTO BIODEGRADACE • Často se stává, že rozklad polutantu není totální (nenastává mineralizace) Lineární alkylsulfonáty BIOTRANSFORMACE MÍSTO BIODEGRADACE BIOTRANSFORMACE MÍSTO BIODEGRADACE • Nedochází k rozkladu až na H2O, CO2, k tvorbě biomasy a energie. • Dochází jen k biotransformaci molekul polutantu na nové sloučeniny, které jsou buď dead-end produkty, nebo nemohou být dále rozkládány vzhledem k podmínkám v prostředí • Tyto meziprodukty mohou mít mnohem nepříznivější vlastnosti pro životní prostředí než původní polutanty BIOTRANSFORMACE MÍSTO BIODEGRADACE < TOXICITA Polychlorované dioxiny BIOTRANSFORMACE MÍSTO BIODEGRADACE Biotransformace může způsobit: 1. Vyšší toxicitu 2. Endokrinní disrupci 3. Mutagenitu 4. Další negativní vlastnosti podle druhu vzniklého metabolitu 5. Zvýšit polaritu a mobilitu v horninovém prostředí MIKROORGANISMY MIKROORGANISMY • Bakterie • Kvasinky • Dřevokazné houby • Plísně • Cyanobakterie VELIKOST MIKROORGANISMŮ MIKROORGANISMY • Bakterie – prokaryontní • Kvasinky, nižší houby, řasy – eukaryontní MIKROORGANISMY • Kvasinky – prakticky se využívají v jediné aplikaci a to při čištění odpadních vod obsahujících fenoly KVASINKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE MIKROORGANISMY • Kvasinky jsou schopné využívat uhlovodíky jako substrát • Historicky se vyráběly tzv. single cell proteiny – kvasinky např. Candida lipolytica, substrát n-hexan. MIKROORGANISMY • Nižší houby – především dřevokazné i) Působící bílou hnilobu dřeva (white- rot-fungi) ii) Působící hnědou hnilobu dřeva (brown-rot-fungi) EXTRACELULÁRNÍ ENZYMY Snažší degradace polutantů – není třeba transport do buňky MIKROORGANISMY • Dřevokazné houby působící hnědou hnilobu – enzymy celulasy – degradace celulosy – zůstává lignin • Dřevokazné houby působící bílou hnilobu – enzymy peroxidasy – degradace ligninu – zůstává celulosa BÍLÁ A HNĚDÁ HNILOBA HOUBY – JAK BY TO MĚLO FUNGOVAT HOUBY – JAK BY TO MĚLO FUNGOVAT DŘEVOKAZNÉ HOUBY - BIOREMEDIACE • Tvorba exoenzymů – peroxidas – zrychlení biodegradace PAU – podobné ligninu, eliminace transportu do buňky • Problém: kolonizace ošetřované půdy • Veliké množství inokula – vysoká cena • Tvorba dead-end produktů, výsledek horší než očekávání – spíše žádný MODEL MOLEKULY LIGNINU DŘEVOKAZNÉ HOUBY – BIOREMEDIACE DALŠÍ PROBLÉM – ODBOURÁVÁNÍ PAU BAKTERIE Diooxygenasa HOUBY Cyt P-450 Peroxidasy POKUSY O PRAKTICKÉ VYUŽITÍ DŘEVOKAZNÝCH HUB PRO BIOREMEDIACI • Earthfax Engineering, Dr. Lamar, Utah, USA • ATE, česká pobočka, Dr. T.M. Vogel, původní technologie francouzská POUŽITÍ HUB, KTERÉ FUNGUJE BIOPULPING POUŽITÍ HUB, KTERÉ FUNGUJE POUŽITÍ HUB, KTERÉ FUNGUJE BIOPULPING • Úspora cca $ 10 na 1 tunu celulosy + úspora 30 % energie • Návratnost investice už za 3 roky !!!! POPŘED OTÁZKY ? DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST ! EXKURZE 3.11.2011 ALFATEX MÓDA, PELHŘIMOV, KŘEMEŠNICKÁ ULICE KONTAMINACE Především chlorované ethyleny: perchlorethylen (PCE) a trichlorethylen (TCE) Transformační produkty (1,2-c-DCE a VC) jen ve velmi omezené míře Podmínky ve zvodni nebyly příznivé pro průběh reduktivní dehalogenace POSTUP REMEDIACE • Odtěžení nejvíce kontaminovaných zemin tam, kde to bylo možné. • Sanační čerpání + vytvoření hydraulické bariéry • Úprava podmínek ve zvodni – podpora biologické reduktivní dehalogenace • Změna podmínek na oxické při hromadění 1,2-c-DCE (IJ-26, IJ-29 až 31)