1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Ekotoxikologie – závěr přednášek nové přístupy a poznatky OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přehled závěrečné přednášky •Moderní přístupy experimentální ekotoxikologie –In vitro modely –Biomarkery a „MOA“ (mode-of-action / omics) techniky • •Modely v ekotoxikologii –SAR a QSAR –AOP / PBPK / TOXCAST – •„Nové“problémy v ekotoxikologii –Nanočástice – •Novinky a zajímavosti 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výzkum mechanismů toxicity in vitro modely a biotesty •Zjišťování účinků (Biologie, Toxikologie a Ekotoxikologie) - existuje velké množství modelů • •Účinky na celých organismech –Standardní biotesty in vivo: legislativa –„Nestandardní“ biotesty in vivo: experimentální výzkumná práce • •Pochopení a identifikace specifických mechanismů působení –In vitro modely: Orgánové / Tkáňové / Buněčné –Výhody •Mechanistické porozumění •Šetření experimentálních zvířat (etické principy „3R“) –Nevýhody •„Jen“ in vitro, chybí komplex a interakce v organismu ____2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výzkumy mechanismů toxicity in vitro modely a biotesty ____3 Práce s in vitro kulturami (kultivační / expoziční nádoby a média) ____1 Sterilní práce s modely in vitro 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Page 5 Počty obratlovců používaných pro hodnocení chemických látek v Evropě Commission of the European Communities, 2010 12 million animals 8.7 %: Toxicology 50 %: Regulatory testing 15 %: Fish, birds, amphibians ~ 80 000 animals 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif In vitro modely v ekotoxikologii 1 – rybí buňky •Rybí buňky in vitro –Relativně snadná izolace buněk a udržování v kultuře (na rozdíl od savčích primárních linií se rybí buňky in vitro chovají jako imortalizované) –Příklady linií •RTL-W1 (Rainbow Trout Liver - W1) •RTgill (Rainbow Trout Gill) –Využití např. pro testování akutní toxicity (snaha o nahrazení testů in vivo) •podobná citlivost s in vivo modely à validace / standardizace • Full-size image (40 K) http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1568988312001412-gr6.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif In vitro modely – stanovení specifických účinků Jaderné receptory – ER, AhR •Toxicita závislá na jaderných receptorech à velký význam v ekotoxicitě (viz jinde v přednáškách) •Jaderné receptory = transkripční faktory –Aktivace receptoru à produkce nových proteinů (zvýšené hladiny = marker expozice) –Možnosti měření •Měření aktivity (např. oxidace – CYP450 – viz dále) •Měření celých proteinů (např. WesternBlotting nebo ELISA) •Měření na úrovni mRNA – genová exprese - PCR nebo kvantitativní PCR •Sleování „reporterových genů“ (viz dále) • •Měření aktivity AhR à indukce detoxikačních enzymů – CYPs –Nejčastěji - měření oxidázové aktivity CYP (metoda EROD) –(využívají se i další analýzy – Wblotting, mRNA …) •Měření aktivity ER à indukce ER-závislých proteinů –Vitellogenin (prekurzor žloutkového proteinu u vejcorodých – ryby, ptáci ..): měření WBlottin, ELISA nebo exprese mRNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Reporterové testy analýza účinků závislých na jaderných receptorech •Specificky vytvořené buněčné linie •Původně odvozené z lidských, potkaních, rybích či jiných tkání •Následná úprava („GMO“) –stabilní transfekce specifickými geny, které se v buňkách normálně nevyskytují –Luciferáza (ze světlušky), Beta-galaktosidáza –Vložení do DNA v místech, která jsou kontrolována příslušným receptorem (AhR, ER…) •Princip – viz obrázek –Měření světla z luciferázy ~ množství dioxinově aktivních látek • •Někdy označované „CALUX“ (Chemical Assissted Luciferase Expression) –jde o komerční název některých buněk, ale v mnoha laboratořích (včetně RECETOX) se užívají principiálně stejné „nekomerční“ buňky (např. H4IIE.luc / MVLD / MDAkb2) – • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení toxicit závislých na intracelulárních receptorech Light Light Luciferase Nuclear Factors 1 P + AhR HSP90 HSP90 Src HSP90 HSP90 Adapted from Blankenship (1994) DRE - Luc AhR ARNT Modulation of Gene Expression ARNT Src “Activated” 2 P P Cytosolic Proteins Membrane Proteins Increased Protein Phosphorylation Ligand (TCDD) Light Light Luciferase Nuclear Factors 1 P + AhR HSP90 HSP90 Src Src HSP90 HSP90 Adapted from Blankenship (1994) DRE - Luc AhR ARNT Modulation of Gene Expression ARNT Src “Activated” 2 P P Cytosolic Proteins Membrane Proteins Increased Protein Phosphorylation 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení aktivit/toxicit závislých na intracelulárních receptorech AhR, ER – experimentální design 96 j. mikrodeska: buněčné linie transgenní: H4IIE.luc – diox. MVLN, T47D.Luc – estrog. Lyza buněk, zamražení (uchování enzymových aktivit) Přídavek vzorků, standardů Expozice (6 – 24 hod) Lumino Stanovení LUCIFERÁZOVÉ (reporterové) aktivity - komerční detekční kity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – využití reporterových testů Hladiny estrogenních látek (stanovení pomocí MVLN testu) na Přítoku a Odtoku ČOV Brno-Modřice • Velká účinnost čištění • Výsledné kncentrace (až 5 ng/L) jsou i tak biologicky účinné ! 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Techniky „OMICS“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Úrovně působení látek v buňce / organismu http://www.omics.jp/about/img/omics_01.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif „Omiky“ –mechanistické změny •Měření na jednotlivých úrovních –Geny – genomika: variabilita mezi jednotlivci, populacemi, druhy / vznik mutací atd. –mRNA – transkripce / transkriptomika – úrovně exprese jednotlivých genů –Proteiny – proteomika - hladiny jednotlivých proteinů –Produkty proteinů / metabolity – metabolomika àVýsledný fenotyp (viditelný projev / změna) àNapř. porucha rozmnožování / smrt http://www.spps.fi/news/0612/Omics1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif MOA (mode of action) techniky •Generování velkých množství údajů (dat) z jednotlivých experimentů •Současné sledování: –Hladiny mRNA - exprese až desítek-tisíc genů –Proteiny – sledování tisíců proteinů –Metabolity – tisíce metabolitů •Moderní techniky molekulární biologie a hmotnostní spektrometrie –Velký rozvoj v posledních 10 letech –Postupné „zlevňování“ à větší dostupnost • – 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - microarrays Exponované vs. Kontrolní 1) Izolace mRNA reverzní transkripce (RT) do cDNA 2) „Obarvení“ (různé barvy Kontrola vs. Exponovaná) 3) Smíchání Exp + Kontrola (stejné celkové koncentrace) 4) Hybridizace na „microarray“ (párování nukleotidů - tisíce předpřipravených cílových DNA na jednom array) 5) Scanování à výsledná barva: analýza relativní exprese (? Které je více ?) Zelená = více „normal“ à snížení exprese u exponovaných Červená = více „exponovaná“ Žlutá = žádná změna http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/microarray_technology.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výsledek – microarrays http://www.springerimages.com/img/Images/BMC/MEDIUM_1471-2164-9-536-2.jpg Výsledek „Heat map“ Změny exprese Různých genů à Náročné statistické zpracování Experimentální varianty K c1 c2 c3 c4 c5 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modely SAR a QSAR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR •SAR = Structure Activity Relationships –hledání vztahů mezi STRUKTUROU a AKTIVITOU látek (struktura -> eko-toxicita) –předpovědi efektů bez nutnosti experimentálních testování • •Řada přístupů –kvalitativní •přítomnost určité charakteristiky implikuje aktivitu (vlastnost) –dlouhý alifatický řetězec -> afinita k membránám – –kvantitativní (=QSAR – Quantitative SAR) •matematický popis vztahů –jednorozměrné vztahy – korelace, regresní vztahy ... –vícerozměrné modelování (PCA, PLS), neuronové sítě ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR v ekotoxikologii •Techniky QSAR původně vyvinuty pro design farmak • •Aplikace SAR, QSAR v ekotoxikologii –předpovědi environmentálně významných parametrů látek •logKow •biokoncentrace, bioakumulace •předpovědi biodegradability a metabolismu –odhady rychlosti degradace t1/2, vznikající metabolity – –předpovědi toxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Princip vývoje modelu QSAR •1) Vstupní data – ZNÁMÉ údaje –Skupina podobných látek –Známá (změřená) vlastnost – např. aktivita / toxicita –Známá fyz-chem data (stovky různých parametrů) •2) Hledání modelu ve známých datech –Např. Aktivita = a * parametr1 + b * parametr2 + c –(viz příklady dále) •3) Využití modelu pro předpověď „Aktivity“ neznámé látky –Fyz-chem parametry à dosazení do modelu à výpočet „toxicity“ – • 1 Příklad – vstupní data pro QSAR Aktivita Chemická data 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady •Předpovědi environmentálně významných parametrů chemických látek (viz také úvod přednášek) –Fyzikálně chemické parametry • Log P (log Kow) • Aqueous solubility • Melting point • Boiling point • Vapour pressure • Henry's law constant • ClogP (www.biobyte.com) • KOWWIN (esc.syrres.com) (www.epa.gov/oppt/exposure/docs/episuitedl.htm) • SLIPPER (www.ibmh.msk.su/qsar/molpro) • KlogP (www.multicase.com) • ABSOLV (www.sirius-analytical.com) • ProLogP (www.compudrug.com) • SPARC (ibmlc2.chem.uga.edu/sparc) • IA (www.interactiveanalysis.com) • ACD (www.acdlabs.com) • QikProp (www.schrodinger.com) • AP-Algorithms (www.ap-algorithms.com) • ProPred (www.capec.kt.dtu.dk) • Cerius2 (www.accelrys.com) • QMPRPlus (www.simulations-plus.com) Příklady software, různé modely a principy výpočtu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady –Předpověď biokoncentrace Modely doporučované TGD (technical guidlines) při registraci nových chemických látek v EU: logKow <6 logBCF = 0.85logKow - 0.7 logKow values 6 – 10 logBCF = -0.2 logKow2 + 2.74logKow - 4.72 –Předpověď biodegradability také někdy: QSBR - jednoduché korelace degradabilita-chemický parametr - sčítání vlivu charakteristických subdomén na degradabilitu ("+" degradace, "-" stabilita) -> suma pro celou molekulu = degradability score - vícerozměrné modelování 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady –Předpovědi toxicity (také označováno – QSTR – Quantitative STRUCTURE-TOXICITY relationships) – 1 Př 1 – toxicita narkotických látek pro ryby (využívána např. i pro účely REACH) log (1/LC50) = 0.907 . log Kow - 4.94 Př 2 – toxicita fenolů pro korýše – vícenásobná regrese (nepolární narkoza – logP, polární toxicita – pKa) 1 Př 3 – vícerozměrné modelování: výsledek analýzy hlavních komponent (PCA) - výstup : odlišení toxických a netoxických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Moderní výpočetní toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Adverse outcome pathways http://u.jimdo.com/www32/o/s09b2938cc0a6d68f/img/idb462b3a2365de42/1314711482/std/toxicokinetic-tox icodynamic-models-and-adverse-outcome-pathways.jpg Viz také dříve v přednáškách: Dokážeme z koncentrace látky v prostředí předpovědět (matematicky) účinky ? Základem je dokonalé porozumění 1) toxikokinetice (modely PBPK – viz dále) a 2) následně mechanismům (dynamika) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PBPK modely PBPK (PBTK) Physiologically based pharmacokinetic (toxicokinetic) models http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/2/22/WholeBody_wiki.svg/220px-WholeBody_wiki.svg.png https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1Xr-zyM_wH8apSCpkALlZltgIBwQ4IcylkdluXxtRsQN mocsqJw Vnitřní „rozdělení“ organismu a parametrizace běžících procesů à Složitý model : Predikce koncentrací v jednotlivých tkáních 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výpočetní model à toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology Koncepční model à ZOOM EE2 – toxikant ER, AR atd. – receptory VTG – vitellogenin (marker toxicity) Každá šipka: zvláštní diferenciální rovnice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology Výsledek: Srovnání MODEL vs. MĚŘENÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Programy US EPA – „Výpočetní toxikologie“ – např „ToxCast“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nano-eko-toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif NANOČÁSTICE •„NANO“ – relativně nová oblast, řada praktických využití •ALE: unikátní vlastnosti –Vlastnosti nanočástic (včetně toxicity) nelze odvodit z vlastností částic z téhož materiálu o větších rozměrech a ani z vlastností chemikálie, ze které je materiál tvořen • •Definice –Nanočástice (nanoparticles): alespoň jeden rozměr <100 nm –Nanočástice přírodního původu - „ultrafine particles“ přítomné v přírodních aerosolech nebo jako vedlejší produkt lidské činnosti (prach, dým, kouř apod.) –Vyráběné nanomateriály (manufactured, engineered NM) –Nanoaerosoly: aerosoly jednotlivých volných nanočástic nebo nanostrukturních částic (= aglomerátů nanočástic nebo nanovláken) – přírodního původu nebo vyráběných 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní charakteristiky vyráběných NM •tvar a struktura částic – –Kulovité nebo nepravidelné částice, trubičky,vlákna, destičky – –Homogenní částice (chemická individua) –Kompozitní nanomateriály(jádro a obal) –Nanočástice 3. a 4. generace (budoucnost: různé komponenty se specializovanými funkcemi („nanodevices“) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní charakteristiky vyráběných NM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady - nanočástice https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR52Y7PdqKN5Z97ZhIFGfyoY41Qv9l41niNcuE3T-F9sWy IjSKMpA http://nano.anl.gov/images/bifunctional_nanoparticle.jpg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR9LiHxdv4f1xLBnJm7j0ey82mAIkrqpx6dVbyiFdDTwcR n5G35 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTRyUwtGdjXOTAe8emSb0Ngkn0R-l8krCeEyFVPeK8-f5Y rg322ug https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1YFciG79F0BpdYj74qJmGI-zgvfT7pAazIR4bDRuhmll hzbqG https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQzw3I5Xb7Vq_3twyU5AzgXl6TZPl1WvVm-RGpTGUQSGNu BdlDu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nanočástice v prostředí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (Eko)toxicita nanočástic – specifické vlastnosti http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0165993611003748-gr1.jpg (Neznámé) parametry částic, které mohou mít vliv na toxicitu Složení (chemické) Povrch (velikost, tvar) Náboj Stabilita Agregace částic Interakce s chemikáliemi Interakce s ionty Vliv na osud látek Přímá toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (Eko)toxicita nanočástic – příklad RECETOX Toxicita – srovnání - 4 „stejné“ částice (jeden výrobce – 4 různé šarže) (zerovalent iron – ZVI – Fe0) Opakovaně pozorována toxicita u částic H16 –příčina neznámá (žádné změny pH, rozpouštění železa či dalších příměsí …) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nanočástice à mechanické vlivy = toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Novinky … stresová biologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Koljušky (ryby), které byly v době kladení vajíček ve stresu (predátor) à Snížená schopnost učení u potomků ! Transgenerační přenos 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Barevnější samci sýkor à Atraktivnější pro samice … à Lepší kvalita spermatu (karotenoidy brání proti oxidativnímu stresu) https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQbhIkN6LbSYHEyRM5L5f20X9xjp7wEr-XtnuPAK_otW_c gy7vt 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotoxicita pesticidů – nové poznatky •Pesticidy – registrace před použitím •Povinné testy účinků na včely à Odvození bezpečného dávkování pro použití • •Nově zjistěné problémy à Jak se projeví „bezpečné koncentrace“ více pesticidů, pokud budou působit současně ? à Jak se projeví u jiných druhů opylovačů než u včel ? • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Čmeláci a pesticidy –Velice významní opylovači –Specifická biologie oproti včelám • kolonie s velmi malým počtem jedinců –Současné aplikace různých pesticidů na sousedních polích •V praxi není koordinace mezi farmáři: koexpozice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vliv pesticidů na čmeláky – polní studie: aplikovány povolené dávky - 2 individuální látky „I“ a „LC“ - současná expozice „M“ (mixed) Celkové ztráty dělnic v průběhu experimentu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vliv pesticidů na čmeláky – polní studie: aplikovány povolené dávky - 2 individuální látky „I“ a „LC“ - současná expozice „M“ (mixed)