6003214-close-up-of-some-isolated-aeromonas-bacteria.jpg Copyright: Sebastian Kaulitzki Identifikace a klasifikace mikroorganismů založená na shlukové analýze MALDI-MS protein/peptidových profilů Zařazení techniky •Hmotnostní spektromentrie • • • • • •V mikrobiologii - chemotaxonomie •Analyzované složky buňky/virů • a) profil extraktu celých buněk, b) biomarkery – vytipované složky • - nejvíce: proteiny/peptidy (ribozomální, membránové) • - méně: sacharidy, lipidy, NK https://figures.boundless.com/17397/large/mass-20spectrometer.png Proč proteiny?? •Vysoce informativní markery současného stavu kultury •„protein turnover“ – změny za různých podmínek prostředí, stresů.. (technologie, transport kultur, vliv látek…) •Systematické mapování proteinů – taxonomie, studium fce proteinů •Databáze proteomu (SWISSPROT) http://www.strongprotein.com/wp-content/uploads/2013/02/Can-a-vegetarian-eat-protein.gif http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c1/Protein-primary-structure.png https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQrvQcAOOzlqZAW7T06rRcaYGUMStXkEkzIPL3Fc0nhPnW VwKwB3Q 3653 • •jednoduchá, rychlá, spolehlivá • chemotaxonomická technika • vysoká citlivost a reprodukovatelnost • • • • MALDI-TOF MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - - Time of Flight Mass Spectrometry biomolekul a unikátních biomarkerů (peptidy a proteiny) měření m/z molekul nabité ionty v plynné fázi bakteriální buňky organické rozpouštědlo silná organická kyselina + + uvolnění Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem Proč proteiny ????? K čemu m/z protein-peptidový profil slouží? •Kvasinky, bakterie, viry, houby.... •Identifikace kmene – po jakou úroveň? •Charakterizace kmene • - sledování profilu kultury (změny proteomu) v průběhu působení faktoru • - sledování mutací • - sledování rezistentních kmenů • - sledování kontaminace kultury •Detekce markerů/biomarkerů, toxinů... • •První databáze – 2004 – Bruker Daltonics • •Smíšené kultury? Biofilm? Vzorky moči? Krve? • 7232 •Proteiny – ribozomu, membrány • • • • • možnost rozlišit • úzce příbuzné druhy, • neodlišitelné genotypizačními metodami a biotypizací • je charakteristickým otiskem analyzovaného bakteriálního kmene 50% sušiny 200 ‑ 6 000 typů molekul = characteristické markery s vysokou rozlišovací silou dostupné analýzou „intaktních“ bakteriálních buněk A. hydrophila ssp. hydrophila 7232T MALDI-MS profil 10/17 •Hmotnostní spektra •Po provedení shlukové analýzy • - dendrogramy Výstupy metody Porovnání spekter 3 typových kmenů různých rodů m/z 0 500 1000 1500 2000 a.i. A. hydrophila ssp.hydrophila CCM 7146T • Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 T Stenotrophomonas CCM 284T Lze hodnotit optickým porovnáním spekter • 4491 4368 4363 4356 4354 2807 1909 1769 667 658 655 srovnání 6000 8000 10000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 a.i. 4491 4368 4363 4356 4354 2807 1909 1769 667 658 655 Porovnání spekter druhů rodu Aeromonas A. caviae “A. trota” A.allo- saccharophila A. schuberttii A. eucrenophila A. sobria A.encheleia A.encheleia A.popoffii A.popoffii A.popoffii • L.casei ssp. casei L. brevis Porovnání spekter kmenů druhu P.aeruginosa (šipka označuje stejné signály odlišné intenzity) • 6000 8000 10000 12000 14000 m/z 0 200 400 600 800 1000 a.i. CCM 1959 CCM 1961 CCM 1960T Možné rozdíly mezi kmeny ??? Nelze hodnotit optickým porovnáním spekter 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5683 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 6210 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5682 Campylobacter coli CCM 6211 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6189 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6191 Campylobacter jejuni CCM 6214 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 7212 Corynebacterium pilosum CCM 6140 Corynebacterium urealyticum CCM 3975 Corynebacterium urealyticum CCM 3976 Corynebacterium urealyticum CCM 4186 Finegoldia magna CCM 3785 Streptococcus mitis CCM 7411 Serratia rubidaea CCM 3412 Peptostreptococcus anaerobius CCM 3790 Staphylococcus epidermidis CCM 2124 Staphylococcus epidermidis CCM 2446 Staphylococcus epidermidis CCM 7221 Staphylococcus saprophyticus CCM 3317 Score Oriented Dendrogram for bruker_ukazky Distance Level 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Serratia liquefaciens 2715 B Serratia liquefaciens 2715 Serratia liquefaciens 2716 Serratia grimesii 2718 Serratia grimesii 4735T Escherichia coli 5172T A Klebsiella pneumoniae 4415 Klebsiella raoultella 3721 Klebsiella raoultella 3722 Aeromonas popoffii 4708T Aeromonas popoffii 4961 Salmonella enterica ssp enterica 4419 Bacillus cereus 1992 Bacillus cereus 2010T Streptococcus mutans 7409T Corynabacterium pilosum 6140T Bacillus subtilis 2216T Bacillus subtilis 2217 Klebsiella pneumoniae 4985 Staphylococcus sciuri ssp rodentium 4657T staphylococcus sciuri ssp. sciuri 3473T Staphylococcus sciuri ssp sciuri 7040 Staphylococcus scuiri ssp carnaticus 4835T Streptococcus salivarius 4046T Distance Level Základy metodiky přípravy a analýzy vzorku – kultura?? Krev/moč?? máte databázi??? 3. MALDI MS analýza Kultivace na vhodném mediu Možné promytí buněk od media Suspenze buňky : rozpouštědlo Kokrystalizace s matricí Reflex IV (Bruker) 4. Úprava a zpracování spekter 5. Testy reprodukovatelnosti 6. Shluková analýza spekter 2. Optimalizace přípravy a analýzy vzorku 1. Kultivace: kmeny pro databázi = typové kmeny (CCM, DSMZ, referenční) Následně neznámé izoláty Vlivy během kultivace? Růstové fáze? Buněčné obaly? Odsolení vzorku? Bakteriální kmen: sbírkový kmen nebo divoký izolát; klinický izolát Příprava vzorku pro analýzu Pelet buněk+ MALDI matrix zaschnutí RT (možno uchovat na desce) Petriho miska Kultivace dle katalogu kultur overnight Bakteriální kolonie Promytá cca v 1 ml sterilní demineralizované vody Zkumavka Eppendorf Centrifugace 5,5 tis. ot/min pelet + 300 μl sterilní demineralizované vody + 900 μl 96% ethanolu Pelet – v eppendorfce v lednici vydrží měsíce Centrifugace 14 tis. ot/min •Každý kmen • - 3 spoty na MALDI desce • - vysušení při RT • •MALDI-TOF MS analýza • • mikromakro N2 laser, 337 nm vzorek + matrix napětí 25 kV urychlené, protonované ionty lehčí = rychlejší ZDROJ DETEKTOR ANALYZÁTOR TOF ionizace 384 možných vzorků •Hluboké vakuum •Citlivost 10 -15 mMALDI destička •ol 9/17 3653 •1 spektrum • - suma 100‑150 zásahů laseru •1 spot = 5 spekter •SOFTWARE SHLUKOVÉ ANALÝZY • 1) FI MU - Ing. Matej Lexa, Ph.D. • - spektra převedena na ASCII formát • (mass range 3 000 ‑ 15 000 m/z) • - transformována do páru vektorů • - je vypočítána jejich cosinová vzdálenost a provedeno hierarchické aglomerativní shlukování založené na vzájemné podobnosti spekter • 2) Biotyper Software (Bruker Daltonics) - komerční Analýza spekter m/z signály A. media CCM 3653T • Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T Rozlišení rodů druhů poddruhů !!! Kmenů !!!! – využití – sledování změn klasifikace jednotlivých kmenů po práci s buňkou • 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h I MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T I MRS+cys Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h II MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h III MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T II MRS+cys Lactobacillus casei subsp casei 7088T III MRS+cys Distance Level MRS MRS+cys Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T Influence of cultivating medium Small variations in spectra do not influence the certain sume of protein/peptide markers that remain constant (Valentine et al. 2005). , • Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T MRS and MRS+cys 20h and 46h cultivation In a total dendrogram different samples of the same strain cultivated different period of time in different media form common branche 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus delbrueckii ssp indicus 845T Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 847T Lactobacillus brevis 1815 Lactobacillus brevis 3805T Lactobacillus parabrevis 778T Lactobacillus fermentum 7192T Lactobacillus casei ssp casei 7088T Lactobacillus paracasei ssp paracasei 792T Lactobacillus paracasei ssp paracasei P1630 Distance Level Jeden rod – rozlišení druhů a kmenů - závislost na počtu zástupců v dendrogramu…. Lactobacillus acidophilus group 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus casei ssp casei 4791 Lactobacillus casei ssp casei 4798 Lactobacillus paracasei ssp paracasei P1630 Lactobacillus paracasei ssp paracasei 792T Lactobacillus casei ssp casei 7088T Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1837 Lactobacillus amylophilus 7001 Lactobacillus pontis 4540T Lactobacillus salivarius 7274 Lactobacillus sakei ssp carnosus 776T Lactobacillus sakei subsp sakei 7203T Lactobacillus coryniformis subsp torquens 646T Lactobacillus fermentum 7192T Lactobacillus reuteri 777T Lactobacillus acidophilus 4833T Lactobacillus kitasatonis 630T Lactobacillus helveticus 3806 Lactobacillus kefiranofaciens ssp kefirangum 245T Lactobacillus kefiranofaciens ssp kefiranofaciens 244T Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus 7190T Lactobacillus delbrueckii ssp indicus 845T Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 847T Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii 7191T Lactobacillus jensenii 243T Lactobacillus animalis 663T Distance Level L. acidophilus groups… - shoda s fylogramem?? Lactobacillus reuteri group Lactobacillus casei group Problematické druhy uvnitř rodu… • • • • • Primáti + člověk Potraviny Janda a Abott, 2010 1951 První asociace s infekcí člověka (fulminantní metastatická myositida) 1968 První větší lékařská zpráva popisující širší spojení humánních infekcí s rodem Aeromonas • geny rezistence • cytotoxické, hemolytické • enteroinvazivní •Gastroenteritidy - A. hydrophila, A. veronii biotyp sobria, A. caviae, A. jandaei, A. trota • •Kůže a měkké tkáně – A. hydrophila , A. schubertii • •Infekce dýchacího traktu, pneumonie – A. hydrophila • •Infekce oka (keratitidy, ulcerace rohovky) - A. caviae • •Intraabdominální infekce – peritonitidy - A. hydrophila, A. veronii; mortalita 56% • •Infekce hepatobiliárního traktu a slinivky - A. hydrophila • •Celulitida, bakteriémie – A. jandaei • •hemolyticko uremický syndrom, urogenitální infekce - A. popoffii, A. caviae • •Septikémie - v 95% A. hydrophila sensu stricto, A. caviae, A. veronii bv. sobria, • A. jandaei, A. veronii bv. veronii, A. schubertii • • • • • • Janda a Abott 2010 Similarita sekvencí NK (97,9‑100% 16S rDNA ) Vysoká fenotypová podobnost (proto HG groups) Problematika nomenklatury - synonyma: „A. trota” - 43 citací (2010) “A. enteropelogenes” - 7 citací, ale prioritně Pomalý vývoj minimálních standardů pro definici nových druhů – např. A. sobria popsána podle 2 kmenů Odlišnosti environmentálních a klinických izolátů? Nespolehlivé komerční sety In vitro – přítomnost faktorů virulence ovlivněna kultivační teplotou A. enteropelogenes a A. caviae 16S rRNA - odlišitelné pouze na základě 1bp genu pro gyrB - odlišnost 57-69 bp A. salmonicida a A. bestiarum 16S rRNA - odlišitelné pouze na základě 2bp biochemicky neodlišitelné A. media/A. eucrenophila A. bestiarum/A. hydrophila A. hydrophila/ A. media – odlišnost jen 3bp Genetické clustry korespondují s populacemi s odlišnou ekologií 16Sr RNA identické A. schuberti/A. encheleia 0 200 400 600 800 1000 A encheleia P1700 A encheleia P2532 A encheleia P1929 A encheleia P2953 A encheleia CCM 7335 A encheleia CCM 7407 A encheleia CCM 7408 A encheleia CCM 4582 A molluscorum CCM 7245 A rivuli CCM 7438 A allosaccharophila CCM 4363 A eucrenophila CCM 4354 A media CCM 3653 A sobria CCM 2807 A sobria P1760 A sobria P2194 A sobria CCM 2808 A sobria P2315 A bestiarum CCM 4707 A salmonicida subsp salmonicida CCM 7246 A salmonicida subsp achromogenes CCM 7233 A salmonicida subsp masoucida CCM 4124 A salmonicida subsp smithia CCM 4103 A salmonicida subsp pectinolytica CCM 7020 A popoffii CCM 4708 A aquariorum CCM 7695 A jandaei CCM 4355 A taiwanensis CCM 7885 A caviae CCM 4491 A sanarellii CCM 7886 A veronii CCM 4359 A hydrophila subsp dhakensis CCM 7146 A hydrophila subsp dhakensis CCM 7329 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2278 A hydrophila subsp hydrophila CCM 7232 A hydrophila subsp ranae CCM 7147 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2280 A hydrophila subsp hydrophila CCM 4528 A hydrophila subsp ranae CCM 7954 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2282 A bivalvium CCM 7467 A enteropelogenes CCM 4368 A cavernicola CCM 7641 A diversa CCM 7325 A schubertii CCM 4356 A schubertii CCM 4357 A simiae CCM 7234 A piscicola CCM 7715 MSP Dendrogram Distance Level A. simiae – 16% k A. schubertii A. bestiarum podle 16S k A. salmonicida A. molluscorum podle 16S k A. encheleia A. sanarelli a A. taiwanensis nezávislé linie, ale vysoká podobnost 0 200 400 600 800 1000 A salmonicida subsp salmonicida CCM 1318 A salmonicida subsp salmonicida CCM 1307 A salmonicida subsp salmonicida CCM 7246 A salmonicida CCM 1275 A salmonicida subsp pectinolytica CCM 7020 A salmonicida subsp masoucida CCM 4124 A salmonicida subsp achromogenes CCM 7233 A salmonicida P2188 A salmonicida P192 A salmonicida subsp smithia CCM 4105 A salmonicida subsp smithia CCM 4103 A salmonicida CCM 1150 A salmonicida subsp smithia CCM 4104 A hydrophila subsp ranae CCM 7954 A hydrophila subsp hydrophila CCM 7232 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2278 A hydrophila subsp hydrophila CCM 4528 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2280 A hydrophila subsp ranae CCM 7147 A hydrophila subsp dhakensis CCM 7329 A hydrophila subsp dhakensis CCM 7146 A hydrophila subsp hydrophila CCM 2282 MSP Dendrogram Distance Level •Podmínky kultivace mají na výsledná spektra malý vliv •určitá hladina konstantních signálů „bazální“ výbavy proteomu (základní hladina proteinů syntetizovaná stále • nezávisle na změně podmínek) •Pomalu rostoucí – prodloužení doby kultivace •Chemikálie – ! nejvyšší čistoty ! (pro MS či HPLC) •Pozor na uvolňování látek z „nekvalitních“ plastů • • •Citlivá analytická ionizační technika MS (UV laser) •Proteomika: šetrná ionizace peptidů a proteinů •Využití MALDI-TOF MS v mikrobiologii: • MALDI-MS profil - identifikace rodu a druhů • - autentizace kmene • - analýza biomarkerů • Klinická diagnostika: Bacillus (i spory), Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Haemophilus (screening nemocničních kmenů), Helicobacter, Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus (MRSA a MSSA) • Rychlá chemotaxonomie – i druhy fenotypicky a genotypicky nerozlišitelné • Enviromentální studie, potravinářství – kontrola čistoty, pg MO • Analýza specifických proteinů bakterií, hub a virů: rekombinantní proteiny, faktory virulence, enzymy, metabolity, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, významné je studium bakteriocinů, peptidové mapování • Sekvenování bakteriálních nukleových kyselin •Referenční spektra: je možno identifikovat neznámý vzorek • • 7232 Využití techniky MALDI-TOF MS Potravinářství, technologie.. •Kontrola kontaminace •Monitoring mutantních kmenů •Potvrzení identity kmene •Kmenově specifické vlastnosti – LAB • - proteolytické, lipolytické… • -------- predikce vlastností „podobných“ kmenů •Biomarkery • • Lactobacillus 52 6-57-5A Green signals – identical to reference signals Yellow signals – identical to reference signals with abberation m/z Red signals – distant signals MALDI-TOF MS Moderní technika pro mikrobiologii •Kapacita v odlišení a klasifikaci kmenů na druhové a poddruhové úrovni (př:MRSA, MSSA!!!) •Přímá identifikace mikroorganismů •rychlý screening či selektivní monitoring patogenů či metabolických produktů MO •Detekce a analýza unikátních proteinů a biomarkerů •Sledování dané kultury v čase!!! Výhody MALDI-MS •Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku •Malý objem vzorku; šetření chemikáliemi •Vysoká citlivost a nízký detekční limit •Vysoce reprodukovatelný výstup • - taxonomie, klin. diagnostika, charakterizace průmysl. kmenů •Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází • a statistického hodnocení výsledků •Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů •Možnost kombinace s dalšími metodami • (off-line separace – ELFO, HPLC) • Výhody MALDI-MS •Vysoce reprodukovatelný výstup bez předchozí separace, filtrování či ošetření buněk •Vysoká rozlišovací schopnost •screening založený na rozšiřující se databázi referenčních spekter mikroorganismů grampositivefinal Zpracováno v projektu: FRVŠ č. 1918 (2008): MALDI-MS v taxonomii prokaryot – inovace výuky mikrobiologie (hlavní řešitel: I. Sedláček).