PROTOKOL: DIFERENCIACE


Diferenciace je rozrůznění buněk vlivem faktorů okolního prostředí.

Při diferenciaci

•         se mění morfologie buněk

•         stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické fosfatázy)

•         stoupá exprese specif. povrchových antigenů (CD11b, CD 14)

•         vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo
chemiluminiscenčně)

•

Metody detekce diferenciace:

Změna enzymového vybavení buněk

•         Nespecifické esterázy - Hydrolýza a-naftyl acetátu esterázami vede k vzniku hnědého
zbarvení

•         Detekce myeloperoxidázy - myeloperoxidáza štěpí peroxid kyslíku za vzniku kyslíkových
radikálů, které pak oxidují o-dianisidin za vzniku barevných látek chinonového charakteru

•         Detekce alkalické fosfatázy - alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl
fosfát za vzniku žlutého zbarvení, které je detekováno spektrofotometrem. Intenzita zbarvení
odpovídá množství alkalické fosfatázy ve vzorku.


Produkce ROS při oxidativním vzplanutí (monocyty)

•         Redukce NBT (nitroblue tetrazolium) - NBT je redukován superoxidem produkovaným monocyty.
Redukce vede k změně barvy ze žluté na modrou

•         Oxidace/redukce luminolu - ROS produkované monocyty oxidují luminol při redukci –
chemiluminiscence


Změna povrchových molekul

•         Exprese CD11b (R proC3b složku komplementu) a CD14 (vazba LPS)

Změna morfologie  Zvýšená adhese, pseudopodia, zástava proliferace



Cíl: Stanovení diferenciace měřením aktivity alkalické fosfatázy u střevní nádorové linie HT-29 po
působení mastné kyseliny butyrátu sodného.


Chemikálie:
  * substrátový pufr
  * 4-p-nitrophenylphosphate ředěný 2mg/1ml substrátového pufru
  * ALP ss 5U/ml
  * 3mM NaOH


pracovní postup:


                  - potřebujeme 0,5 . 10^6 buněk

- stočit (200G/5min) a odsát médium (v tomto kroku je možné pelet zamrazit a pokračovat jindy)

- opláchnout substrátovým pufrem

-pelet rozpipetovat v 500ul substrátového pufru a dát na led

- sonikovat 5x10s (s mezichlazením) při nastavení 1 (25W)

- stočit

- vzorky nakapat do jamek (96-jamková deska) po 50ul

- stejně nakapat i blank (substrátový pufr) a kalibrační křivku (ředění ALP)

- přidat do jamek 50ul substrátu (4-p-nitrophenylphosphate - ředěný 2mg/1ml substrátového pufru)

- inkubovat 30min v 37°C

- přidat 50ul 3mM NaOH

- změřit absorbanci na Fluostaru při 405nm


Ředění pro kalibrační křivku:

- zásobní roztok ALP 5U/ml = 0,25U/50ul  ředit 250x substrátovým pufrem (do 500ul dát 2ul ALP) a
dostanu 0,001U/50ul. Dále ředit substrátovým pufrem 1:1 :

               0,0005U/50ul

               0,00025U/50ul

               0,000125U/50ul

               0,0000625U/50ul

               0,00003125U/50ul

               0,000015625U/50ul


Substrátový pufr:

- rozpustit 10,05ml diethanolaminu v 70ml destilované vody

- nastavit pH na 9,7

- navážit 0,1016g MgCl[2].6H[2]O a rozpustit ho v 10ml destilované vody

- smíchat s diethanolaminem a dlouho míchat

- doředit destilovanou vodou na 100ml