PROTOKOL:   Barvení jader pomocí DAPI


Během interfáze je DNA dekondenzována a v jádře  probíhá transkripce. Zatímco během mitózy, která
předchází buněčnému dělení, je DNA  vysoce kondenzovaná a pozorovatelné jsou jednotlivé chromozómy.
V mitóze dochází  ke zdvojení obsahu DNA a jejímu následnému rozdělení do dceřiných buněk.

K zviditelnění DNA se využívej  barviva fluorescenční. Fluorescence je schopnost některých látek po
ozáření světlem o kratší vlnové  délce (excitační záření) emitovat světlo o delší vlnové délce. Lze
rozlišit dva typy  fluorescence primární/autofluorescenci a sekundární fluorescenci.
Autofluorescence je  schopnost některých přirozeně se vyskytujících látek, jako je například
chlorofyl, fluoreskovat  po dopadu UV záření. Sekundární fluorescencí rozumíme fluorescenci barviva
tzv.  fluorochromu kovalentně navázaného na sledované buněčné struktuře. Fluorochrom DAPI prochází
buněčnou membránou se váže do A-T  oblastí DNA  (1 molekula DAPI na 3 AT-páry) a  po ozáření UV
světlem dochází k excitaci a následné emisi fluorescence. Po vazbě DAPI na DNA se až 20× zesiluje
intenzita fluorescence, protože nedochází ke zhášení fluorescence molekulami vody v roztoku. Po
navázaní má DAPI 4,6-diamino-2-fenylindol  excitaci 358nm  emisi 461nm.


Materiál: kultura epiteliálnich adherentních buněk  WB-F344 (in vitro model jaterních oválných
buněk)


Chemikálie:
  * DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) c =1ug/ml– váže se na DNA
  * Mowiol – fixace na skle


Pracovní postup:


·        oplach buněk EDTA/PBS

·        sběr buněk pomocí trypsinu

·        100ul buněčné suspenze opláchnout PBS

·        centrifugace 200g/5min, odsát

·        přidat 1ml EtOH  zafixovat  1 hod  při 4 °C

·        přidat 1ul DAPI a inkubovat 20 min ve tmě

·        centrifugace 200g/5min, odsát

·        resuspendovat v 1ml PBS

·        centrifugace 200g/5min, odsát

·        k peletu přidat 6ul Mowiolu, promíchat a odkápnout na sklíčko

·        přikrýt krycím sklíčkem a nechat zatuhnout 24h

·        sledováni jader pomocí fluorescenčního mikroskopu

·         počítaní 200 jader / na vzorek



  cell nukleus


http://sciencehastheanswer.blogspot.cz/2012/11/seeing-cells.html




   apoptotic cell -  in box


http://www.flickr.com/photos/exothermic/2560318717/