Moderní metody buněčné biologie
Izolace RNA
Extrakce a izolace RNA
Klasická metoda:
Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-Step Method of RNA Isolation by Acid
Guanidinium Thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162,
156-159 (1987).
nevýhody – vyžaduje extenzivní používání organických
rozpouštědel a je náročná na použití inhiborů RNáz
(např. e.g. guanidinium isothiocyanate (GITC))
výhoda - cena
komerčně dodávána jako TRI Reagent nebo TRIzol.
Extrakce a izolace RNA
Klasická metoda:
Metoda je založena na fázové separaci - po
centrifugaci vzorku ve směsi vodu nasyceného fenolu,
chloroformu a GITC.
Po centrifugaci je RNA přítomná ve vodné fázi,
zatímco DNA a proteiny jsou soustředěny v interfázi
mezi horní vodnou a dolní organickou fází.
Po odebrání vodné fáze je získaná RNA precipitována
pomocí 2-propanolu nebo ethanolu, vysušena a
rozpuštěna v H2O nebo TE pufru..
Důležité si uvědomit:
 je třeba bránit degradaci RNA prostřednictvím
RNáz
 odstranit kontaminující DNA (RNA)
• nedotýkat se vzorků, pracovat v rukavicích
• používat inhibitory RNáz, např. GITC
Metody odstraňující DNA kontaminaci:
 oligo d(T) metody (použitelné pro eukaryotickou mRNA)
• využití polyadenylovaného konce eukaryotické mRNA
• hybridizace oligo d(T) s mRNA
• separace vázané mRNA (centrifugací, magneticky)
DNA
mRNA
pellet
 pomocí DNázy
1. kontaminující DNA je rozložena rDNázou
2. DNáza je odstraněna
Metody odstraňující DNA kontaminaci:
Extrakce a izolace RNA
Izolace pomocí komerčních kolonových kitů:
Buňky jsou lyzovány v roztoku s vysokou koncentrací
chaotropních iontů (zároveň okamžitě denaturují
RNázy), které napomáhají vazbě RNA na silika
membránu.
Kontaminující DNA je odstraněna pomocí
rekombinantní DNázy aplikované na membránu:
membrána je poté, většinou dvoukrokově, promyta
pufry, které odstraní soli, metabolity a zbylé
buněčné makromolekuly.
Čistá RNA je eluována pomcí ultračisté vody bez
RNáz nebo TE pufru.
Izolace RNA pomocí kitů
Izolace RNA pomocí kitů
Stanovení koncentrace a čistoty RNA:
• spektrofotometricky
A260 – 1.0 ~ 40 mg/ml
A260/A280 ~ 2.0
• gelová elektroforéza
• RNA analyzéry
Degradace RNA na gelové elektroforéze
Nové technologie pro analýzu čistoty a koncentrace NK
NanoDrop® ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer
Small samples: designed for 1 ul samples
Dynamic range: measures 2-3700 ng/ul (dsDNA) on a
single sample.
Full Spectrum (220-750nm)
10 second measurement time
No cuvettes or capillaries
Nové technologie pro analýzu čistoty a koncentrace NK
Agilent 2100 Bioanalyzer
http://www.chem.agilent.com/scripts/ge
neric.asp?lPage=1565&indcol=N&prodcol=
Y
Podrobný popis:
• protokol pro izolaci celkové RNA z kultivovaných buněk pomocí
kitu NucleoSpin®RNA II (cvičení Moderní metody buněčné
biologie);
• úplná anglická verze protokolu:
http://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/RNA%20and%20mRNA/UM_TotalRNA.pdf